同時(shí)檢測(cè)四種病原菌的PCR方法的研究.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來(lái)食品安全問(wèn)題的一個(gè)顯著特點(diǎn)，在各種食品安全事件中，細(xì)菌性食物中毒則是食物中毒的重要因素。常見(jiàn)的食源性致病菌主要有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌、致瀉性大腸桿菌等。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)食品中致病菌主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要一周才能完成，且靈敏度較低。近年來(lái)，針對(duì)某一種或一類致病菌的檢驗(yàn)方法被建立起來(lái)，但是一旦檢測(cè)的方向有誤就會(huì)造成時(shí)間和藥品的浪費(fèi)。因此，急需建立一種快速

2、有效且通量較高的檢測(cè)方法。 為建立一種同時(shí)檢測(cè)四種常見(jiàn)動(dòng)物源致病菌的PCR方法。本研究針對(duì)大腸桿菌的(16s-23s rRNA)基因、金黃色葡萄球菌的(nuc)基因、單增李斯特氏桿菌的(hlyA)基因以及沙門氏菌的(invA)基因分別設(shè)計(jì)合成了四對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增的目的基因片段分別為662 bp、484 bp、372 bp、284 bp。試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)多重反應(yīng)體系中引物添加量、鎂離子濃度、dNTP添加量及退火溫度、延伸溫度等

3、影響要素進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜的多重反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，其反應(yīng)體系為10×PCR buffer5μL，Mg2+(25mM)3μL，dNTP(25 mM)4μL，Taq酶(2.5 U)1μL，模板各2μL，引物按文中所述終濃度各1.5μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至50μL。多重PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃起始變性5 min，94℃變性45 s，57℃退火1 min，70℃延伸1 min30 s，擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)于70℃延伸20 min。