免疫磁珠—實(shí)時(shí)熒光PCR聯(lián)用技術(shù)快速檢測食品中單增李斯特菌的研究.pdf

1、食品安全是食品中有毒有害物質(zhì)對(duì)于人體健康影響的重大公共衛(wèi)生問題。食源性致病菌是引起食品安全的最主要的來源。其中單增李斯特菌是一種極其常見的致病菌，可引起腦炎、腦膜炎、敗血癥、膿腫及孕婦流產(chǎn)等一系列食源性李斯特菌病，病死率較高，可達(dá)30％～70％。目前傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法存在費(fèi)時(shí)耗力等缺點(diǎn)，常規(guī)PCR方法有前處理時(shí)間長、易污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等缺點(diǎn)。因此，建立食品中單增李斯特菌的快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法具有非常重要的實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值。

2、　　本研究應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)，從污染菌很少的樣品中快速富集單增李斯特菌，以集菌方法代替增菌培養(yǎng)，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，提高單增李斯特菌的檢出率，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高檢測效率。
　　本實(shí)驗(yàn)通過比較EDC/NHS濃度、活化時(shí)間、抗體濃度、偶聯(lián)時(shí)間和偶聯(lián)溫度等條件對(duì)免疫磁珠捕獲單增李斯特菌效率的影響，確定免疫磁珠制備的具體流程:將磁珠用PBST(pH=6.0)清洗，加入475μL PBST(pH=7.4)和25μL1mg/mL抗體，室

3、溫下孵育2h后，分離，并封閉。再通過比較檢測過程中免疫磁珠用量、富集時(shí)間和洗滌液pH，確定最佳條件:將100μL的免疫磁珠加至100μL的菌液中，在28℃、180rpm恒溫?fù)u床中孵育1h后，置于磁力架上進(jìn)行分離，棄去上清液，用500μLPBS(pH=7.4)重復(fù)洗滌3次，最后用50μLPBS(pH=7.4)重懸，用于下一步實(shí)驗(yàn)。將免疫磁珠富集分離的單增李斯特菌提取DNA模板后，用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，檢測條件經(jīng)優(yōu)化后選擇:PCR反應(yīng)體系:

4、Premix Taq:12.5μL，ROX reference Dye:0.5μL，上游引物（10pmol/mL）:1μL，下游引物（10pmol/mL）:1μL，Taqman探針(10pmol/mL):1μL，雙蒸水:4μL，DNA模板:5μL，總體積為25μL。PCR溫度設(shè)置:第一階段:95℃，2min;第二階段:95℃，5s，60℃，35s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
　　本方法可以實(shí)現(xiàn)102～106CFU/mL檢測范圍內(nèi)線性相關(guān)度良