莖環(huán)型引物-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)奶粉中單增李斯特菌的研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌,是一種能夠引起人畜共患病的食源性致病菌,屬李斯特菌屬。廣泛分布于自然界,食用了被單增李斯特污染的食物,可導(dǎo)致人和動(dòng)物敗血癥、流產(chǎn)、腦膜炎等,病死率高達(dá)30％～70%,是人類最重要的食源性病原菌之一。單增李斯特菌的檢測(cè)、鑒定以及防控技術(shù)已經(jīng)受到極大的關(guān)注,其檢測(cè)方法一直沿用過(guò)去傳統(tǒng)的分離鑒定方法,己不能適應(yīng)現(xiàn)代快速檢測(cè)的要求。
　　 環(huán)介導(dǎo)

2、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一種新穎的核酸體外擴(kuò)增技術(shù),具有簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),已經(jīng)應(yīng)用于檢測(cè)病原菌等諸多領(lǐng)域。該方法自身最大的局限性就是易出現(xiàn)假陽(yáng)性。施本研究利用LAMP技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌,對(duì)LAMP引物進(jìn)行設(shè)計(jì)、篩選及改進(jìn),選擇帶有一定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物,避免由于多條引物在同一條件下擴(kuò)增,可能互補(bǔ)擴(kuò)增而出現(xiàn)的假陽(yáng)性,進(jìn)一步提高LAMP檢測(cè)的準(zhǔn)確性,可

3、稱之為莖環(huán)型引物-LAMP(Stcnnloop-PrimerLoop-mediatedIsothermalAmplification,簡(jiǎn)稱SLP-LAMP)。
　　 本試驗(yàn)以單增李斯特菌hlyA基因?yàn)榘谢?應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorer.tp/lamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)篩選出一套具有一定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的LAMP引物,建立了莖環(huán)型引物-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌的方法。對(duì)

4、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、Mg2+濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,確定25μL的SLP-LAMP反應(yīng)體系為:內(nèi)引物FIP和BIP各1.0μmol/L,外引物F3和B3各0.2μmol/L,dNTPs0.4mmol/L,MgCl24mmol/L,,10×BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液2.5μL,8U/μL的BstDNA聚合酶0.6μL,DNA模板1.5μL,滅菌的去離子水補(bǔ)足體系。SLP-LAMP反應(yīng)過(guò)程是首先在63℃水浴鍋中反應(yīng)50min,然后將其放入

5、80℃水浴鍋中,水浴5min終止反應(yīng),通過(guò)肉眼觀察有無(wú)白色焦磷酸鎂沉淀,即可判斷是否發(fā)生了SLP-LAMP反應(yīng),亦可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)反應(yīng)是否發(fā)生。通過(guò)限制性內(nèi)切酶ClaⅠ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物,測(cè)得酶切片段與理論預(yù)期值相符,驗(yàn)證了方法的正確性。
　　 本研究對(duì)3株單增李斯特菌、5株李斯特屬的非單增李斯特菌株和14株其他食源性致病菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果表明,3株單增李斯特菌結(jié)果為陽(yáng)性,其他19株菌株為陰性。研究了6種從人工污染單增李斯

6、特菌的奶粉中提取模板DNA的方法,結(jié)果表明SLP-LAMP檢測(cè)對(duì)制備模板DNA方法的要求不高。
　　 本研究對(duì)SLP-LAMP法快速檢測(cè)單增李斯特菌進(jìn)行了研究,確定了檢測(cè)純培養(yǎng)物的靈敏度,人工污染檢出限,并與普通PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明:SLP-LAMP檢測(cè)單增李斯特菌的靈敏度為2.45×10-1CFUJ/mL,其對(duì)人工污染奶粉樣品的檢出限為7.32×10-1CFU/mL。采用試劑盒提取DNA,從樣品處理到報(bào)告結(jié)果,耗

7、時(shí)2h。而對(duì)照,PCR檢測(cè)單增李斯特菌純培養(yǎng)物的靈敏度為2.45×103CFU/mL,人工污染單增李斯特菌的檢出限為7.32×103CFU/mL。采用同樣方法提取DNA,從樣品處理到報(bào)告結(jié)果,耗時(shí)4h。
　　 研究表明,本研究建立的SLP-L,AMP法檢測(cè)食品中單增李斯特菌的方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高,方便快捷、成本低等特點(diǎn),并且通過(guò)大量的試驗(yàn)證明,篩選設(shè)計(jì)帶有莖環(huán)型引物對(duì)避免反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性起到了一定的作用。為L(zhǎng)AMP的檢