食品中單增李斯特菌快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種重要人畜共患病的病原體，主要污染肉、蛋、奶、水果和蔬菜等。我國(guó)單增李斯特菌的檢測(cè)主要是選用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，基于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的目的，免疫學(xué)與分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展。
　　本研究主要依據(jù)國(guó)家食品安全檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB4789.30-2010，結(jié)合一系列的快速檢測(cè)技術(shù)，如顯色培養(yǎng)基、蛋白條檢測(cè)法、CPA恒溫?cái)U(kuò)增法、實(shí)時(shí)熒光PCR方法以及全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)等，

2、完成對(duì)樣品的進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。
　　研究中選用單增李斯特菌純菌以及四種典型的即食食品（肉類、海產(chǎn)品、奶制品以及水果和蔬菜），對(duì)國(guó)內(nèi)外常用的四類核酸提取方法（沉降法、磁珠法、離心柱法以及熱解法）進(jìn)行方法比對(duì)，選擇穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)的方法作為后期核酸提取的首選方法。研究表明，離心柱法操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，靈敏度和特異性高，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作和經(jīng)驗(yàn)要求不高，易于掌握。
　　利用標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)3種單增李斯特菌快速檢測(cè)方法的靈敏度、特異性進(jìn)

3、行比對(duì)，然后選取典型即食食品鹽水鴨和涼拌菜，通過(guò)人工布菌的方法對(duì)3種方法進(jìn)行深入比較研究。結(jié)果表明，蛋白條檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低；CPA恒溫?cái)U(kuò)增法克服了蛋白條檢測(cè)法靈敏度低的不足，不需要大型的檢測(cè)儀器，適用于基層實(shí)驗(yàn)室；實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度高、特異性好，同時(shí)還避免了常規(guī)PCR需要進(jìn)行電泳的過(guò)程，減少交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)周期短，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)條件比較完備的實(shí)驗(yàn)室。
　　單增李斯特菌檢測(cè)中死/活菌的檢測(cè)是一個(gè)難題，排除死

4、菌核酸對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響顯得極其重要。實(shí)驗(yàn)中選用PMA進(jìn)行死/活菌檢測(cè)的研究，結(jié)果表明在純培養(yǎng)物中PMA可以較好的排除死菌的干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但在基質(zhì)干擾情況下效果不理想，很容易受到雙鏈非目標(biāo)基因的影響，造成PMA的大量損耗，影響檢測(cè)結(jié)果。
　　基于以上研究，將核酸提取技術(shù)與快速檢測(cè)方法相結(jié)合，建立食品中單增李斯特菌快速檢測(cè)方法，并通過(guò)對(duì)大量實(shí)際樣品檢測(cè)進(jìn)行方法的驗(yàn)證與優(yōu)化。操作步驟：按照GB4789.30-2010對(duì)樣品進(jìn)行