廣東省食品中單增李斯特菌的污染狀況及其PFGE分子分型研究.pdf

1、食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來(lái)，在世界范圍內(nèi)食品安全方面的惡性和突發(fā)事件屢屢發(fā)生。李斯特菌病已成為全球性食源性疾病之一，在國(guó)際上受到高度重視。因此，對(duì)該病的病原學(xué)研究十分重要。 研究目的 1.從食物種類、時(shí)間、地點(diǎn)三個(gè)方面分析廣東省有代表性的食品中單增李斯特菌的污染狀況及其流行趨勢(shì)。 2.應(yīng)用PFGE對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行分子分型，分析廣東省有代表性的食品中單增李斯特菌的分子流行病學(xué)特征。

2、3.建立食品中單增李斯特菌的PFGE數(shù)據(jù)庫(kù)。 研究方法 1.單增李斯特菌的檢驗(yàn) 1.1樣品來(lái)源 1.1.1采樣時(shí)間：在2002年至2005年四年期間，根據(jù)廣東省的特殊氣候，每個(gè)采樣點(diǎn)分春冬和夏秋各采樣一次。 1.1.2采樣地點(diǎn)：為了使采集的樣品達(dá)到較好的均衡性和全面性，在地理分布上兼顧了全省的東南西北部，選取地點(diǎn)有山區(qū)、平原和沿海地區(qū)，既有經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的地區(qū)，也有經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后的地區(qū)，這樣采集的樣品能真

3、實(shí)地反映廣東省食品的污染情況。選取的地點(diǎn)有韶關(guān)(包括仁化和始興)、湛江、深圳、廣州(包括增城和番禺)、汕頭(澄海)和海豐；從2004年開始增加了肇慶、東莞、珠海、江門和中山共11個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)。 1.1.3樣品種類和數(shù)量：采集的食品有生肉(雞、豬、牛和羊)，無(wú)定型包裝熟肉、生牛奶、酸奶、冰淇淋、水產(chǎn)品和蔬菜，每年檢測(cè)樣品400～600份。后來(lái)增加的5個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)由地方疾病預(yù)防控制中心每年采樣并檢測(cè)80份樣品，陽(yáng)性菌株上送廣東省疾病預(yù)防控制

4、中心。 1.2檢驗(yàn)方法： 參照全國(guó)食源性致病菌檢測(cè)工作手冊(cè)和GB／T 4789.30-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》方法進(jìn)行檢測(cè)，獲得陽(yáng)性菌株，并保存菌種。 1.3數(shù)據(jù)分析： 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪制統(tǒng)計(jì)圖。 2．單增李斯特菌PFGE分子分型方法的建立 2.1 PFGE原理： 將細(xì)菌包埋于瓊脂凝膠塊中，用溶菌酶和蛋白酶K將細(xì)菌菌體

5、和蛋白質(zhì)消化，釋放出完整的細(xì)菌染色體DNA，再用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在原位對(duì)整個(gè)細(xì)菌染色體DNA進(jìn)行酶切，酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過(guò)電場(chǎng)方向不斷交替變換及合適的脈沖時(shí)間等條件下而得到良好的分離。 2.2 PFGE方法： 參照美國(guó)PulseNet的單增李斯特菌PFGE分子分型標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。 2.3數(shù)據(jù)分析： 采用比利時(shí)Applid Maths公司的BioNumeric

6、s關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)軟件進(jìn)行圖像分析，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行比對(duì)和相應(yīng)分析。 研究結(jié)果 1.廣東省有代表性的食品中單增李斯特菌的污染狀況 本研究從2002年-2005年一共檢測(cè)了2100份食品，其中有90份樣品檢出單增李斯特菌，陽(yáng)性率為4.29％。按檢出單增李斯特菌陽(yáng)性率由高到低排列：生雞肉為7.90％、生羊肉為7.46％、熟肉制品為7.21％、生牛肉為4.17％、生豬肉為3.42％、水產(chǎn)品為3.18％、色拉為2.61％、蔬菜

7、為1.28％、冰淇淋和生牛奶為0。 廣東省的氣候比較特殊，每年7-9月是廣東省最熱的季節(jié)，但檢出率卻最低為3.58％，1-3月是廣東省最冷的季節(jié)，檢出率卻最高為11.21％。2002年-2005年檢出率分別為1.57％、3.77％、8.68％和3.16％，檢出率從2002年逐年上升至2004年達(dá)高峰，2005年回落。 2002年-2005年韶關(guān)檢出單增李斯特菌陽(yáng)性率最高為9.22％，依次為汕頭5.43％、深圳5.03％、

8、廣州4.67％、湛江1.95％。 2．PFGE方法建立與實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 根據(jù)PFGE實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果，把細(xì)菌菌懸液的濁度調(diào)整為0.85-0.90，比標(biāo)準(zhǔn)方法的0.79-0.82要高，因?yàn)榫吭礁撸珼NA的含量也會(huì)越高，電泳出來(lái)的圖譜DNA的亮度也會(huì)相應(yīng)變強(qiáng)。由于細(xì)胞裂解2小時(shí)的DNA圖譜比細(xì)胞裂解3小時(shí)的圖譜缺失了分子量最大的1條DNA片段，故把細(xì)胞裂解時(shí)間2小時(shí)改為3小時(shí)。對(duì)于21cm×14cm的膠，電泳時(shí)間21小時(shí)會(huì)

9、使H9812最小分子量的DNA片段跑到膠的底部，超出要求范圍(距膠的邊緣1.0-1.5am)之外，故把電泳時(shí)間從21小時(shí)改為20小時(shí)。其余條件不變。 3．應(yīng)用PFGE方法，分析廣東省有代表性的食品中單增李斯特菌的分子流行病學(xué)特征 食物種類、采樣時(shí)間和采樣地點(diǎn)相同，單增李斯特菌出現(xiàn)相同的PFGE圖譜，并且相似值為100％，為同一基因分型，說(shuō)明這些分離株具有極高的同源性。 若食物種類、采樣時(shí)間和采樣地點(diǎn)都不相同，單增

10、李斯特菌出現(xiàn)相同的PFGE圖譜，為同一基因分型，說(shuō)明這些分離株親緣關(guān)系很近。 韶關(guān)(仁化、始興)、惠州、汕頭(澄海)和湛江各自有本地區(qū)特有的PFGE圖譜，提示為有本地區(qū)特有的分離株。廣州(番禺、增城)、深圳、中山、肇慶和珠海沒(méi)有本地區(qū)特有的PFGE圖譜，佛山、海豐和揭陽(yáng)各檢出1株單增李斯特菌，各自獨(dú)立分為1個(gè)型。 4．單增李斯特菌PFGE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 應(yīng)用PFGE方法對(duì)107株(其中90株為本實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)所得，17

11、株為地方疾病預(yù)防控制中心上送菌株)分離自廣東省食品中的單增李斯特菌進(jìn)行分子分型，用AscI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，可產(chǎn)生8-14條DNA片段，分子量大小在20kb—1100kb之間。用BioNtimerics V4.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，根據(jù)電泳產(chǎn)生條帶的位置和數(shù)量的不同，共分為41個(gè)不同的型別，相似值在54.4％-100％。這些實(shí)驗(yàn)菌株表現(xiàn)出較大的遺傳多樣性。 結(jié)論 1.廣東省食品存在單增李斯特菌的污染，20

12、02年-2005年單增李斯特菌的陽(yáng)性率為4.29％。在生雞肉、生羊肉、生牛肉、生豬肉、熟肉制品、水產(chǎn)品、色拉和蔬菜等大多數(shù)食品中均可檢出該菌。檢出率從2002年開始逐年上升，至2004年達(dá)高峰，2005年回落。其中韶關(guān)地區(qū)食品中單增李斯特菌的陽(yáng)性率最高，表明邊遠(yuǎn)山區(qū)單增李斯特菌污染食品的機(jī)會(huì)較多。 2.首次應(yīng)用PFGE方法對(duì)107株分離自廣東省食品中的單增李斯特菌進(jìn)行分子分型，共分為41個(gè)不同的型別，這些實(shí)驗(yàn)菌株在整體上表現(xiàn)出較