單增李斯特菌抗次氯酸鈉脅迫機(jī)制的初步研究.pdf

1、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種常見的革蘭氏陽性食源性致病菌。它廣泛存在于土壤、奶制品和即食食品中，是近年嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全的主要致病菌。老年人、小孩、孕婦等免疫力低下的人群易感染單增李斯特菌，感染后的致死率高達(dá)30％。單增李斯特菌能夠適應(yīng)低溫、酸性、高滲透壓、氧化脅迫等不良環(huán)境，造成已消毒食品的二次污染。
　　次氯酸鈉是一種常見的消毒劑，它具有強(qiáng)氧化性，能對細(xì)胞中重要的蛋白質(zhì)、核酸以及脂質(zhì)分子

2、造成氧化損傷。細(xì)菌對氧化脅迫的防御是一個(gè)復(fù)雜的過程，通常伴隨著氧化調(diào)控因子的參與，包括對氧化劑的解毒作用和對受損細(xì)胞的修復(fù)作用。此外，大量分布在細(xì)胞質(zhì)中的還原性低分子量巰基蛋白不但能夠中和細(xì)胞中的氧化劑，還可以保護(hù)細(xì)胞中重要蛋白不被氧化。在單增李斯特菌中，SOD酶、KAT酶、Lmo1604蛋白具有分解活性氧（ROS）的功能。單增李斯特菌中重要的壓力脅迫調(diào)控因子sigB對氧化脅迫的調(diào)控作用還存在爭議，但氧化脅迫調(diào)控因子 PerR被證明在過

3、氧化氫脅迫下有抗氧化脅迫作用。此外，研究表明，重要的低分子量巰基蛋白谷胱甘肽、NADPH、谷胱甘肽還原酶和 Grx共同組成的谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)與硫氧還蛋白還原酶及MetA、MetB蛋白組成的硫氧還原系統(tǒng)在細(xì)菌遭遇氧化脅迫的過程中發(fā)揮的作用的機(jī)制還尚不清楚。
　　在本研究中我們用半致死濃度的次氯酸鈉（3 mM）脅迫單增李斯特菌WaX12以及sigB基因缺失株WaX12-ΔsigB，通過觀察脅迫中細(xì)菌生理生化變化、抗氧化脅迫酶變化以

4、及細(xì)胞中重要抗氧化脅迫基因變化情況進(jìn)一步研究了單增李斯特菌的抗氧化機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單增李斯特菌對次氯酸鈉有較強(qiáng)的耐受能力，在半致死濃度3 mM仍能存活1 h以上，但濃度超過3 mM后，細(xì)菌的存活能力明顯下降。次氯酸鈉能通過破壞單增李斯特菌的細(xì)胞膜入侵細(xì)菌造成氧化損傷，引起細(xì)菌體內(nèi)ROS水平上升。結(jié)果發(fā)現(xiàn),30 min及以上的脅迫時(shí)間下細(xì)菌體內(nèi)的ROS水平更為活躍。而細(xì)菌體內(nèi)的SOD酶在30 min和45 min時(shí)酶活較高

5、，KAT酶在45 min時(shí)酶活最高。隨后在相同程度的致死劑量下，我們比較了次氯酸鈉脅迫和 H2O2脅迫下細(xì)菌溶血活性的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，次氯酸鈉脅迫下的細(xì)菌溶血活性更低。反映了次氯酸鈉對細(xì)菌毒力的影響作用更大，這可能是與次氯酸鈉能夠特異靶向含巰基蛋白有關(guān)。
　　進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)基因perR， trxA， sigB在半致死濃度次氯酸鈉脅迫下的表達(dá)最為活躍。且隨著時(shí)間的變化，更多的基因在脅迫后期有較高的表達(dá)量。trxA是修復(fù)Met蛋

6、白的重要基因，trxA的活躍表達(dá)說明Met可能在次氯酸鈉脅迫下有重要的作用。隨后我們通過人為添加Met觀察其抵御氧化脅迫的效果。發(fā)現(xiàn)加入Met后細(xì)菌的存活率顯著提高，且細(xì)菌中 GSH的含量明顯高于未添加 Met的細(xì)菌。值得注意的是，這一現(xiàn)象在H2O2脅迫作用中并不明顯。
　　最后我們通過比較菌野生株 WaX12與 WaX12-ΔsigB的耐受程度及菌內(nèi)的活性氧水平來探究單增李斯特菌 sigB基因?qū)Υ温人徕c脅迫的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)野

7、生株和sigB基因突變株的表型測定結(jié)果顯示，野生株比缺失株更耐次氯酸鈉脅迫，而且此現(xiàn)象在穩(wěn)定期更加明顯；當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，突變株內(nèi)的活性氧水平增長率比野生株高出19.97%，進(jìn)一步說明sigB基因?qū)Υ温人徕c脅迫有一定的調(diào)控作用。RT-PCR結(jié)果表明，基因 lmo1433、grx和 ohrR基因在野生株的表達(dá)水平顯著高于突變株（P＜0.01），而基因lmo0906、lmo2770的表達(dá)水平在野生株和缺失株中的差異并不明顯。研究