單增李斯特菌抗次氯酸鈉脅迫機制的初步研究.pdf

1、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種常見的革蘭氏陽性食源性致病菌。它廣泛存在于土壤、奶制品和即食食品中，是近年嚴重危害公共衛(wèi)生安全的主要致病菌。老年人、小孩、孕婦等免疫力低下的人群易感染單增李斯特菌，感染后的致死率高達30％。單增李斯特菌能夠適應低溫、酸性、高滲透壓、氧化脅迫等不良環(huán)境，造成已消毒食品的二次污染。
　　次氯酸鈉是一種常見的消毒劑，它具有強氧化性，能對細胞中重要的蛋白質、核酸以及脂質分子

2、造成氧化損傷。細菌對氧化脅迫的防御是一個復雜的過程，通常伴隨著氧化調控因子的參與，包括對氧化劑的解毒作用和對受損細胞的修復作用。此外，大量分布在細胞質中的還原性低分子量巰基蛋白不但能夠中和細胞中的氧化劑，還可以保護細胞中重要蛋白不被氧化。在單增李斯特菌中，SOD酶、KAT酶、Lmo1604蛋白具有分解活性氧（ROS）的功能。單增李斯特菌中重要的壓力脅迫調控因子sigB對氧化脅迫的調控作用還存在爭議，但氧化脅迫調控因子 PerR被證明在過

3、氧化氫脅迫下有抗氧化脅迫作用。此外，研究表明，重要的低分子量巰基蛋白谷胱甘肽、NADPH、谷胱甘肽還原酶和 Grx共同組成的谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)與硫氧還蛋白還原酶及MetA、MetB蛋白組成的硫氧還原系統(tǒng)在細菌遭遇氧化脅迫的過程中發(fā)揮的作用的機制還尚不清楚。
　　在本研究中我們用半致死濃度的次氯酸鈉（3 mM）脅迫單增李斯特菌WaX12以及sigB基因缺失株WaX12-ΔsigB，通過觀察脅迫中細菌生理生化變化、抗氧化脅迫酶變化以

4、及細胞中重要抗氧化脅迫基因變化情況進一步研究了單增李斯特菌的抗氧化機制。
　　實驗結果顯示，單增李斯特菌對次氯酸鈉有較強的耐受能力，在半致死濃度3 mM仍能存活1 h以上，但濃度超過3 mM后，細菌的存活能力明顯下降。次氯酸鈉能通過破壞單增李斯特菌的細胞膜入侵細菌造成氧化損傷，引起細菌體內ROS水平上升。結果發(fā)現(xiàn),30 min及以上的脅迫時間下細菌體內的ROS水平更為活躍。而細菌體內的SOD酶在30 min和45 min時酶活較高

5、，KAT酶在45 min時酶活最高。隨后在相同程度的致死劑量下，我們比較了次氯酸鈉脅迫和 H2O2脅迫下細菌溶血活性的變化，實驗結果表明，次氯酸鈉脅迫下的細菌溶血活性更低。反映了次氯酸鈉對細菌毒力的影響作用更大，這可能是與次氯酸鈉能夠特異靶向含巰基蛋白有關。
　　進一步的研究發(fā)現(xiàn)基因perR， trxA， sigB在半致死濃度次氯酸鈉脅迫下的表達最為活躍。且隨著時間的變化，更多的基因在脅迫后期有較高的表達量。trxA是修復Met蛋

6、白的重要基因，trxA的活躍表達說明Met可能在次氯酸鈉脅迫下有重要的作用。隨后我們通過人為添加Met觀察其抵御氧化脅迫的效果。發(fā)現(xiàn)加入Met后細菌的存活率顯著提高，且細菌中 GSH的含量明顯高于未添加 Met的細菌。值得注意的是，這一現(xiàn)象在H2O2脅迫作用中并不明顯。
　　最后我們通過比較菌野生株 WaX12與 WaX12-ΔsigB的耐受程度及菌內的活性氧水平來探究單增李斯特菌 sigB基因對次氯酸鈉脅迫的調控作用。我們發(fā)現(xiàn)野

7、生株和sigB基因突變株的表型測定結果顯示，野生株比缺失株更耐次氯酸鈉脅迫，而且此現(xiàn)象在穩(wěn)定期更加明顯；當脅迫時間達到30 min時，突變株內的活性氧水平增長率比野生株高出19.97%，進一步說明sigB基因對次氯酸鈉脅迫有一定的調控作用。RT-PCR結果表明，基因 lmo1433、grx和 ohrR基因在野生株的表達水平顯著高于突變株（P＜0.01），而基因lmo0906、lmo2770的表達水平在野生株和缺失株中的差異并不明顯。研究