模擬糞便標(biāo)本中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan雙重Real-time PCR檢測(cè)方法及初步應(yīng)用性評(píng)價(jià).pdf

1、目的：建立一種TaqMan雙重Real-time PCR方法，用于模擬糞便標(biāo)本中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速檢測(cè)。
　　方法：以單增李斯特菌特異基因hly和伊氏李斯特菌特異基因smcL作為靶基因，合成2對(duì)引物和其相應(yīng)的熒光探針，優(yōu)化各個(gè)反應(yīng)組分的濃度和實(shí)時(shí)熒光PCR循環(huán)程序，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立從模擬糞便中直接檢測(cè)單增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan雙重Real-time PCR方法。利用李斯特菌屬中其它種李斯特菌及常見(jiàn)致病

2、菌驗(yàn)證引物、探針的特異性；通過(guò)制備模擬糞便標(biāo)本并對(duì)其進(jìn)行二次增菌后，分別提取 DNA，采用 TaqMan雙重Real-time PCR進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到快速檢測(cè)單增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。
　　結(jié)果：采用本研究建立的TaqMan雙重Real-time PCR方法對(duì)模擬糞便標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果顯示特異性良好，與其他種李斯特菌和其他病原茵均無(wú)交叉反應(yīng)。模擬糞便中檢測(cè)靈敏度分別為2.45×103CFU/g和2.92×103CFU/g；模擬

3、糞便標(biāo)本在3h內(nèi)可得出檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)模擬糞便標(biāo)本中單增李斯特菌含量為6CFU/g和伊氏李斯特菌含量為5CFU/g時(shí)，經(jīng)過(guò)增菌后使用雙重Real-time PCR方法可檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。
　　結(jié)論：本研究建立了以單增李斯特菌的特異基因 hly和伊氏李斯特菌的特異基因smcL為靶基因的TaqMan雙重Real-time PCR檢測(cè)方法，該方法具有特異性好、敏感性高、快速易操作等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床、食品及環(huán)境標(biāo)本的快速診斷，以及我國(guó)人群中單增