熒光定量PCR檢測豬肉中單核細胞增生性李斯特氏菌的研究.pdf

1、單核細胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特，它是一種能夠引起人畜共患的食源性致病菌，屬李斯特菌屬。它在自然界中分布廣泛，如土壤、腐敗的蔬菜及多種食品中。食用了被單增李斯特污染的食物后可以引起“李氏桿菌病”，使人和動物患腦膜炎、敗血癥、流產等，死亡率可達20％～30％。傳統(tǒng)的檢測單增李斯特的方法操作繁瑣、檢測時間較長，通常需要5～7 d 才能完成且靈敏度較低。因此需要建立快速、靈敏的單增李斯特的

2、檢驗方法。熒光定量 PCR 技術已經成為針對食源性致病菌的一種常規(guī)的分子檢測方法，廣泛應用于食品檢測中，靈敏度好檢出率高，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。
　　 本試驗利用熒光定量與鎖定寡核苷酸相結合的方法快速檢測單核增生性李斯特氏菌。試驗中我們選取hlyA基因作為靶基因，但針對這個基因我們發(fā)現(xiàn)其片段的GC含量非常低，通常在40％以下，

3、這就造成不能設計出合適的引物和探針，從而造成信號收集效果差，試驗靈敏度低，影響檢出率。為了克服這個問題，我們采取熒光定量PCR檢測手段和鎖定寡核苷酸（LNA）相結合的方法進行檢測。鎖定核苷酸是雙核酸結構，在試驗中可以增強寡核苷酸的親和力和檢測的特異性，并且加強寡核苷酸鏈的穩(wěn)定性和堿基堆積力，從而提高試驗的準確性和靈敏度。
　　 本研究利用專業(yè)軟件設計出合適的特異性引物和探針，經過普通PCR擴增后，獲得119 bp產物并將PCR產

4、物進行2 ％的瓊脂糖凝膠電泳，產物膠回收純化后連接到pUC119載體上，并轉化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，對陽性克隆進行了篩選鑒定，構建了目的重組質粒，作為標準品繪制標準曲線。并對插入的外源基因進行了測序，與文獻報道的序列相似性達到100％，從而證實PCR擴增產物確為目的擴增產物。構建的重組質?？梢缘玫捷^好的擴增曲線和Ct值。試驗中對比三種從豬肉中提取單增李斯特的方法，確定優(yōu)選，還利用普通PCR確定引物特異性良好。
　　

5、對PCR反應體系中退火溫度、引物探針配比等進行了優(yōu)化，以確定適宜PCR反應體系和PCR擴增程序。適宜反應體系為：12.5 μL PremiXEXTaq(2×)，上、下游引物(各10 μM)各0.5 μL，1μL目的探針（3 μM）,2 μL模板,8.5 μL滅菌雙蒸水，總反應體系25 μL；適宜擴增程序為：95℃預變性10 S，再按94℃ 5 S－60℃30 S進行45個循環(huán)。
　　 本方法純菌培養(yǎng)物檢測靈敏度可以達到30 co