Sigma B在單核細胞增生李斯特菌耐受抗生素中的作用.pdf

1、[目的]單核細胞增生李斯特菌是重要的革蘭氏陽性食源性致病菌。近年來的報道顯示該菌耐受抗生素的能力有不斷增強的趨勢。Sigma B(σB，李斯特菌中應對環(huán)境脅迫的主要調(diào)控因子)在多種革蘭氏陽性細菌中負責壓力應答轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌對抗生素的耐受。為了探討單核細胞增生李斯特菌的耐藥機制，我們對Sigma B在耐受抗生素中的作用進行了初步研究。
　　 [方法]①建立并優(yōu)化檢測單核細胞增生李斯特菌耐藥程度，利用噻唑

2、藍活體染色法(MTT法)檢測最小抑菌濃度(MIC)；②檢測和比較單核細胞增生李斯特菌野生菌株EGDe和其σB缺失突變菌株EGDe△sigB對盤尼西林青霉素、氨芐西林青霉素、利福平、硫酸慶大霉素、四環(huán)素鹽酸和紅霉素六種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)；③在測定的MIC的基礎上，利用MTT法比較EGDe和EGDe△sigB在1×MIC、2×MIC和8×MIC的氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平三種抗生素中的生長活性，繪制生長遲滯曲線。④采用反轉(zhuǎn)錄

3、PCR(RT-PCR)方法，檢測EGDe和EGDe△sigB兩種菌株在有和無利福平脅迫下四個基因rpoB、rsbU、kat和fri(這四個基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達量在革蘭氏陽性菌的模式菌枯草芽孢桿菌中與利福平的脅迫正相關，因此作為單核細胞增生李斯特菌耐受利福平的Marker)的表達量，從轉(zhuǎn)錄水平分析EGDe和EGDe△sigB菌株中這四個基因與利福平之間的關系，探究σB介導的單核細胞增生李斯特菌耐受抗生素的分子機制。
　　 [結(jié)

4、果]①EGDe對盤尼西林青霉素(0.16μg/mL)、四環(huán)素鹽酸(0.25μg/mL)和硫酸慶大霉素(0.5μg/mL)的MIC高于EGDe△sigB(分別為0.08μg/mL、0.125μg/mL和0.125μg/mL)；四環(huán)素對EGDe的最小抑菌濃度是對EGDe△sigB的最小抑菌濃度的兩倍，慶大霉素對EGDe的最小抑菌濃度是對EGDe△sigB的最小抑菌濃度的四倍。而此兩種菌株對氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平的MIC沒有差別，分別

5、為0.19μg/mL、0.125μg/mL和10.032μg/mL。②比較氨芐西林青霉素、紅霉素和利福平對EGDe和EGDe△sigB的生長遲滯曲線顯示，EGDe△sigB對這三種抗生素的添加更為敏感，恢復生長所需的遲滯時間更長，而且其遲滯程度隨著抗生素濃度的增加而增強。③EGDe和EGDe△sigB在有和無利福平脅迫下四個基因rpoB、rsbU、kat和fri的轉(zhuǎn)錄表達結(jié)果顯示：rpoB的表達不依賴σB，也不受抗生素脅迫的影響，表達量

6、在兩種菌株中以及有無抗生素脅迫均穩(wěn)定不變；kat和fri的表達與σB正相關，而且受到利福平的誘導；在沒有利福平時，EGDe△sigB中rsbU的表達明顯高于EGDe，當給予利福平刺激(4×MIC)，EGDe△sigB中rsbU的表達下降，EGDe中rsbU的表達上升，并稍高于EGDe△sigB中rsbU的表達，暗示rsbU的表達不僅與利福平脅迫相關，而且似乎在sigB缺失時有補償其功能的作用。
　　 [結(jié)論]在多數(shù)革蘭氏陽性菌如

7、枯草芽孢桿菌和金黃色葡糖球菌中，壓力脅迫應答調(diào)控因子Sigma B參與耐受外界多種不利因素。我們的實驗結(jié)果也表明，σB在單核細胞增生李斯特菌對抗生素的耐受中起到重要調(diào)節(jié)作用。σB不僅參與耐受作用細胞膜的抗生素，還參與耐受抑制蛋白質(zhì)合成類抗生素。單核細胞增生李斯特菌耐受利福平的分子機制與枯草芽孢并不完全相同，表明細菌對抗生素的耐受機制具有種屬特異性。對不同細菌的耐藥機制進行深入研究，將有助于研發(fā)新的抗菌藥物，以及正確合理地應用現(xiàn)有抗菌藥物