單核細(xì)胞增生李斯特菌ActA蛋白脯氨酸重復(fù)區(qū)的功能研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）為兼性胞內(nèi)寄生菌，在土壤、污水等自然界中廣泛存在，可以通過污染的乳制品或肉類等食物感染人和動(dòng)物，是一種重要的食源性人獸共患病原菌。在Lm多種毒力因子的協(xié)同作用下，能夠穿越宿主的腸道屏障、血腦屏障、血胎屏障，引起敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)為特征的李斯特菌病，孕婦、新生兒、老年人和免疫功能低下者為易感人群。Lm被機(jī)體攝入后，能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，并且逃離宿主吞噬體，同時(shí)利用

2、宿主肌動(dòng)蛋白聚集成彗星尾狀結(jié)構(gòu)，從而在胞質(zhì)內(nèi)運(yùn)動(dòng)及在細(xì)胞間擴(kuò)散傳播。這種聚集宿主肌動(dòng)蛋白的過程需要肌動(dòng)蛋白聚集因子ActA的參與，因此ActA被認(rèn)為是Lm逃離宿主自噬和在細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)過程中最為重要的毒力因子。ActA蛋白根據(jù)功能分為3個(gè)功能區(qū):氨基端、脯氨酸重復(fù)區(qū)與羧基端，其中脯氨酸重復(fù)區(qū)具有4個(gè)脯氨酸重復(fù)序列（Proline repeated regions，PRRs），主要與細(xì)菌的胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)與肌動(dòng)蛋白尾的形成有關(guān)。并不是所有的Lm菌株，

3、都具有完整的4個(gè)PRRs，有些菌株缺失1或2個(gè)PRRs，這種缺失對(duì)致病性的影響存在爭(zhēng)議。本文以天然缺失1個(gè)PRR的4b血清型菌株LmNTSN作為研究材料，以其ActA蛋白作為研究對(duì)象，使用非吞噬細(xì)胞及小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，深入研?b型菌株ActA蛋白脯氨酸重復(fù)區(qū)的功能，為揭示ActA的致病機(jī)理提供了新認(rèn)識(shí)。
　　1、Lm菌株actA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析及其突變株的構(gòu)建
　　以人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2作為為體外感染模型，利用實(shí)時(shí)

4、熒光定量PCR的方法，對(duì)Lm NTSN侵襲Caco-2細(xì)胞后的26種毒力及毒力相關(guān)基因（actA、hly、mpl、prfA、plcA、ami、dltA、bpA、hfq、inlC、inlH、inlK、sigB、virR、virS、lntA、oppA、prsA2、aut、pdgA、srtA、mprF、murA、secA2、sod、vip）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，在體外感染條件下，Lm感染Caco-2細(xì)胞后其actA基因上調(diào)表達(dá)32

5、0倍，virS、vip、mpl、plcA、lntA、inlK、inlC基因也均顯著上調(diào)表達(dá)。提示了actA等8個(gè)毒力基因在侵襲非吞噬細(xì)胞過程中發(fā)揮了重要作用。
　　對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中58株Lm的ActA蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，22株Lm在脯氨酸重復(fù)區(qū)存在35aa缺失，恰好形成一個(gè)PRR，其中包括本實(shí)驗(yàn)室分離的4b血清型菌株Lm NTSN，而國(guó)際通用的1/2a型標(biāo)準(zhǔn)菌株EGDe則具有完整的4個(gè)PRRs。進(jìn)一步分析其來源與血清型

6、，22株脯氨酸重復(fù)區(qū)缺失的菌株中有7株為4b血清型，均為從患李斯特菌病的人或動(dòng)物分離的菌株。值得一提的是，在所有譜系Ⅰ(37.9％)和譜系Ⅱ(32.7％)的菌株中，譜系Ⅰ中脯氨酸重復(fù)區(qū)缺失菌株(59％)的比例顯著高于譜系Ⅱ中的菌株數(shù)量(9％)，提示這種PRR的缺失具有譜系特異性。
　　為了研究ActA脯氨酸重復(fù)區(qū)的功能，本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了三株突變株:修復(fù)了PRRs序列的替換突變株Lm NTSN(actA-105)，將Lm

7、 EGDe的actA基因替換到LmNTSN基因組中的替換突變株Lm NTSN(actA-FL)，actA基因的缺失突變株Lm NTSNAactA。以actA外側(cè)基因序列的PCR擴(kuò)增與基因測(cè)序，證實(shí)三株突變株均構(gòu)建成功，為ActA脯氨酸重復(fù)區(qū)的研究提供了生物材料。
　　2、ActA蛋白脯氨酸重復(fù)區(qū)的功能研究
　　對(duì)BHI培養(yǎng)基中Lm生物膜形成能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，actA基因缺失株形成生物膜的能力顯著下降(P＜0.01)，提

8、示actA基因能夠促進(jìn)4b血清型菌株Lm NTSN體外生物膜的形成。
　　選用人宮頸癌細(xì)胞系Hela作為體外感染模型進(jìn)行細(xì)胞黏附、侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與野生株相比，Lm NTSN(actA-105)對(duì)細(xì)胞黏附侵襲的能力均顯著降低(p＜0.05)。空斑形成試驗(yàn)表明，Lm NTSNAactA不能形成空斑，而Lm NTSN、NTSN(actA-105)、NTSN(actA-FL)均能有效的形成空斑，但與野生株相比，Lm NTSN(act

9、A-105)形成空斑數(shù)量較少，且空斑直徑顯著減小(P＜0.001)。細(xì)菌感染Hela細(xì)胞后形成肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)果顯示，LmNTSNAactA不能聚集肌動(dòng)蛋白;而Lm NTSN(actA-105)聚集肌動(dòng)蛋白的能力弱于野生株和Lm NTSN(actA-FL)，不能形成肌動(dòng)蛋白絲或形成的肌動(dòng)蛋白絲較短;NTSN(actA-FL)聚集肌動(dòng)蛋白的能力與野生株無明顯差異。提示缺失1個(gè)PRR的野生株Lm NTSN對(duì)非吞噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的黏附侵襲能力，且

10、肌動(dòng)蛋白的聚集與肌動(dòng)蛋白尾的形成能力更強(qiáng)。
　　此外，以小鼠為體內(nèi)感染模型，通過LD50及不同感染途徑下臟器細(xì)菌載量的測(cè)定，對(duì)野生株與突變株的致病力進(jìn)行了研究。LD50結(jié)果顯示，Lm NTSNAactA的毒力比野生株降低了247倍，Lm NTSN(actA-105)、NTSN(actA-FL)的毒力與野生株沒有明顯差別。在口服(i.g.)、腹腔(i.p.)和尾靜脈(i.v.)三種感染途徑下，Lm NTSN(actA-105)在脾臟

11、中定植的細(xì)菌載量均顯著高于野生株（i.g.:P＜0.05; i.p.:P＜0.05; i.v.:P＜0.01），且在口服感染途徑下肝臟中的載菌顯著高于野生株(P＜0.01); Lm NTSN(actA-FL)在脾臟中的細(xì)菌載量均顯著高于野生株（i.v.:P＜0.01;i.p.:P＜0.01;i.g.:P＜0.05），且口服和腹腔感染途徑下肝臟中的載菌量顯著高于野生株（i.p.:P＜0.01;i.g.:P＜0.05）。綜上所述，Lm NT

12、SN(actA-105)與LmNTSN(actA-FL)在小鼠臟器中的定植能力均高于野生株，提示完整的PRRs更有利于細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的定植。
　　本研究對(duì)4b型菌株Lm NTSN的ActA蛋白脯氨酸重復(fù)區(qū)的功能進(jìn)行了初步研究，體外感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脯氨酸重復(fù)區(qū)的缺失，對(duì)于Lm NTSN黏附、侵襲非吞噬細(xì)胞及細(xì)胞中的運(yùn)動(dòng)過程中均發(fā)揮重要作用。但在小鼠的體內(nèi)感染過程中，不同感染途徑下，修復(fù)了脯氨酸重復(fù)區(qū)的菌株在小鼠臟器中的定植能力均強(qiáng)