單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力基因actA轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的初步研究和缺失突變株的構(gòu)建.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌，簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌（LM）是常見(jiàn)的食源性致病菌，2002年被WHO列為僅次于大腸桿菌O157，沙門(mén)氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。單增李斯特菌是一種人畜共患病李斯特菌病的病原，主要通過(guò)食用被LM污染的食品而感染。孕婦、嬰兒、老年人及免疫力低下者如腫瘤、AIDS的患者均容易引起感染，導(dǎo)致胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等。歐美國(guó)家曾多次發(fā)生該菌引起的食物中毒，死亡率達(dá)30％以上。一方面，LM對(duì)食品的污染與危害，

2、已引起世界各國(guó)的普遍關(guān)注和高度重視；另一方面，在逐步研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，LM具有顯著激發(fā)強(qiáng)烈的CD4+／CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)和較弱的體液反應(yīng)能力，減毒LM突變株因而可以成為研制新型抗感染藥物和生物治療腫瘤的理想外源性抗原表達(dá)載體，減毒LM是非常有前景的疫苗載體。鑒于LM的致病原理主要是毒力因子的協(xié)作參與，對(duì)于LM毒力基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究就是一個(gè)尤為重要的課題。本研究通過(guò)同源重組的方式，在基因組中已經(jīng)缺失了inlB毒力基因（ΔinlB L

3、M）基礎(chǔ)上再進(jìn)行actA基因的缺失，由此獲得LMΔinlB／actA減毒突變株；同時(shí)構(gòu)建表達(dá)GFP的LM，并以突變株開(kāi)展了GFP用于PrfA調(diào)控毒力基因actA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究。 減毒突變株的獲得不僅對(duì)李斯特菌病的預(yù)防具有重要作用，為L(zhǎng)M闡明毒力因子的致病機(jī)理與免疫防護(hù)作用提供條件，為構(gòu)建預(yù)防人類(lèi)和動(dòng)物李斯特病的疫苗載體奠定基礎(chǔ)；并且，缺失突變株的獲得也有助于對(duì)LM毒力基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，起到提高食品衛(wèi)生安全作用和促進(jìn)其在臨床

4、上應(yīng)用的實(shí)現(xiàn)。 一單核細(xì)胞增生李斯特菌LM4inlB／acth減毒突變株的構(gòu)建及鑒定actA和inlB基因的編碼產(chǎn)物ActA和InlB是與其致病性相關(guān)的重要毒力因子，本研究通過(guò)刪除這兩個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)野生型菌株LM的減毒；在以前的研究結(jié)果（基因組中inlB基因已經(jīng)成功缺失）基礎(chǔ)之上，進(jìn)行actA基因的敲除。利用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增待刪除基因actA上游c、下游d片段，通過(guò)pUC18-actA（c+d）克隆載體的構(gòu)建，將其拼接在一起，測(cè)序

5、后插入穿梭載體pLSV101中，經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入 LMΔinlB。通過(guò)溫度和紅霉素抗性壓力，實(shí)現(xiàn)同源重組，對(duì)重組克隆用PCR方法進(jìn)行鑒定，將陽(yáng)性克隆命名為L(zhǎng)MΔinlB／actA。 二GFP介導(dǎo)的PrfA調(diào)控毒力基因actA轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究構(gòu)建表達(dá)融合載體pLSV16-PactA-gfp將無(wú)啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因gfp與毒力基因actA啟動(dòng)子融合，然后將其電轉(zhuǎn)化入LM野生株P(guān)14、PrfA高表達(dá)突變株P(guān)14a和prfa基因等位缺失突變

6、株A42中進(jìn)行表達(dá)，利用熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)上述三株細(xì)菌中綠色熒光蛋白的不同表達(dá)強(qiáng)度，從而評(píng)價(jià)actA基因依賴于PrfA的轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)弱，以研究PrfA轉(zhuǎn)錄調(diào)控毒力基因表達(dá)的分子機(jī)制；結(jié)果顯示：綠色熒光蛋白在P14a中發(fā)出的熒光強(qiáng)度最高，P14次之，A42最弱，兩兩比較均有顯著差異（p<0.01），表明毒力基因actA的轉(zhuǎn)錄水平高低與PrfA的活性成正相關(guān)，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)依賴于PrfA的調(diào)控。 本研究所獲得的減毒突變株毒力水平有