單核細(xì)胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的構(gòu)建及部分生物學(xué)特性研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性致病菌，可以引起人和動物流產(chǎn)、腦膜腦炎、敗血癥等癥狀，是一種對公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)危害較大的人獸共患病原菌，被世界衛(wèi)生組織（WHO）認(rèn)定為四大食源性致病菌之一。該菌廣泛存在于自然環(huán)境中，對低溫、高滲、酸性、堿性、消毒劑等外界環(huán)境具有廣泛適應(yīng)性，這種毒力和應(yīng)激能力與其表達(dá)的毒力因子、環(huán)境應(yīng)激因子以及相關(guān)調(diào)控分子密切相關(guān)。非編碼 RN

2、A(ncRNA)作為一種調(diào)控分子可以通過調(diào)節(jié)毒力基因和環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)來影響 LM毒力及其環(huán)境應(yīng)激能力。目前，利用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)在 LM中已經(jīng)鑒定出多種 ncRNAs，這些 ncRNAs與 LM毒力、環(huán)境應(yīng)激、金屬離子轉(zhuǎn)運、生物膜生成、糖代謝、侵染、胞內(nèi)寄生等生命活動密切相關(guān)。Rli60屬于 LM ncRNAs中的成員之一，其功能至今尚不清楚。鑒于此，本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建 rli60及 ncRNA伴侶分子 hfq

3、基因缺失株，通過分析缺失株與母源株毒力和環(huán)境應(yīng)激等表型差異并研究 Rli60調(diào)控相關(guān)基因相對轉(zhuǎn)錄水平變化，以期揭示 Rli60對 LM毒力和環(huán)境應(yīng)激的調(diào)控作用。
　　研究方法和主要研究結(jié)果如下：
　　1. LM ncRNA rli60和伴侶分子 hfq基因的克隆、分子特征分析及其缺失株的構(gòu)建與鑒定
　　擴增、克隆 LM-SB5 rli60及伴侶分子 hfq基因并測序，對 ncRNA Rli60二級結(jié)構(gòu)、潛在作用靶點及

4、hfq基因的分子特征進行分析。分別擴增 rli60及 hfq基因上、下游同源臂，采用重疊延伸 PCR（SOE-PCR）得到 rli60和 hfq基因缺失的融合片段△ rli60和△ hfq，構(gòu)建具有氯霉素抗性的 pKSV7-△ rli60和 pKSV7-△ hfq重組穿梭質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至 LM-SB5感受態(tài)細(xì)胞中，在溫度和氯霉素的雙重選擇壓力下進行同源重組；篩選無氯霉素抗性的基因缺失株，并檢測其遺傳穩(wěn)定性。利用 qRT-PCR檢測 hfq

5、基因缺失對 rli60基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果成功克隆了 rli60和 hfq基因，分析顯示 rli60基因全長246 bp，二級結(jié)構(gòu)呈“X”型莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包含9個環(huán)狀結(jié)構(gòu)和5段互補的雙鏈結(jié)構(gòu)，其潛在作用靶點包括 hly、inlF、dltA、rsbU、gltD、mpl等與毒力及環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的基因。hfq基因全長234 bp，編碼77個氨基酸，對推導(dǎo)的 Hfq氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)從 N端到 C端包含1個α-螺旋及5個β-折疊，具有 RNA結(jié)合

6、位點及六聚體結(jié)合位點，可能在參與 LM ncRNAs調(diào)節(jié)基因表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。同時，成功構(gòu)建并篩選得到遺傳性穩(wěn)定的基因缺失株 LM-△rli60與 LM-△hfq，重組缺失株經(jīng) PCR鑒定得到與缺失后的預(yù)期值1543 bp及1421 bp相符的目的條帶。在 LM-△hfq中，rli60基因的相對轉(zhuǎn)錄水平為0.91，與 LM-SB5相比其轉(zhuǎn)錄水平并無顯著變化（p>0.05），表明 Rli60在 LM中可能通過不依賴于 Hfq蛋白的方

7、式發(fā)揮作用。
　　2. ncRNA rli60基因缺失對 LM環(huán)境應(yīng)激及生物膜生成能力的影響
　　為了解 rli60基因缺失對 LM-SB5環(huán)境應(yīng)激能力及生物膜生成能力的影響，通過檢測 LM-SB5與 LM-△ rli60在不同溫度、pH、高滲及乙醇條件下的環(huán)境應(yīng)激能力及生物膜生成能力，并利用 qRT-PCR檢測生物膜生成相關(guān)基因 gltB和 gltC轉(zhuǎn)錄水平，分析 rli60基因缺失對 LM環(huán)境應(yīng)激及生物膜生成能力的影響。

8、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 LM-SB5株相比，LM-△ rli60對30℃低溫、42℃高溫、堿性、3.5％乙醇環(huán)境應(yīng)激能力及在48 h的生物膜生成能力顯著減弱（p<0.05）。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，LM-△ rli60中 gltB基因的轉(zhuǎn)錄水平在24 h及48 h顯著降低（p<0.05），gltC基因的轉(zhuǎn)錄水平在48 h顯著降低（p<0.05），推測 Rli60通過影響生物膜生成基因 gltB、gltC的表達(dá)而導(dǎo)致生物膜生成能力下降。研究結(jié)果

9、表明，ncRNA Rli60對 LM環(huán)境應(yīng)激及生物膜生成發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。
　　3. ncRNA rli60基因缺失對 LM毒力的影響
　　通過動物感染試驗檢測 LM-SB5與 LM-△ rli60對昆明系小鼠的 LD50，肝、脾載菌量及對肝、脾、腎的病理損傷；利用溶血試驗及磷脂酶試驗檢測 LM-SB5與 LM-△ rli60的溶血活性及磷脂酶活性；通過細(xì)胞侵染試驗分析 LM-SB5與 LM-△ rli60對小鼠巨噬細(xì)胞

10、 RAW264.7的黏附力、侵襲力、胞內(nèi)生存增殖能力并利用 qRT-PCR檢測毒力基因相對轉(zhuǎn)錄水平，分析 rli60基因缺失對 LM毒力的影響。結(jié)果顯示，與 LM-SB5相比，LM-△ rli60對昆明系小鼠的 LD50上升了2.12個對數(shù)數(shù)量級，毒力顯著降低（p<0.05）；肝、脾載菌量顯著下降；對肝、脾、腎的病理損傷也有所減弱。LM-△ rli60較 LM-SB5溶血能力下降了4倍；二者均具有一定磷脂酶活性。LM-△ rli60對細(xì)

11、胞黏附力顯著升高，侵襲力及胞內(nèi)的生存增殖能力顯著降低（p<0.05）；毒力基因相對轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生顯著變化，其中 prfA、inlA、inlB基因在 LM-△ rli60中相對轉(zhuǎn)錄水平升高，plcA、hly、actA基因在 LM-△ rli60中相對轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（p<0.05）。研究結(jié)果表明，ncRNA Rli60對 LM毒力發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。
　　本研究通過同源重組方法構(gòu)建了 rli60基因缺失株 LM-△ rli60，并