單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的構(gòu)建及其蛋白質(zhì)組學(xué)特性研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是重要的人畜共患李斯特菌病的病原菌，在食品公共衛(wèi)生領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，該菌的致病性與調(diào)控因子PrfA(positive regulatory factor A)蛋白作用下毒力基因的表達(dá)有著密切的關(guān)系。PrfA是李斯特菌最重要的毒力調(diào)控因子之一，能調(diào)節(jié)LIPI-Ⅰ、LIPI-Ⅱ上毒力基因的表達(dá)，從而對(duì)李斯特菌黏附及侵襲宿主細(xì)胞、逃離機(jī)體免疫應(yīng)答起到調(diào)控作用。雖然目前

2、對(duì)PrfA的調(diào)控作用有了一定的了解，但是其在Lm致病中的作用尚未完全闡明。本研究通過同源重組技術(shù)構(gòu)建單核細(xì)胞增生性李斯特菌的prfA基因缺失株，并在此基礎(chǔ)上對(duì)突變株的生物學(xué)特性和蛋白質(zhì)組學(xué)特性進(jìn)行鑒定，以期完善PrfA的調(diào)控機(jī)制，為L(zhǎng)m的致病機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　 1、單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的構(gòu)建
　　 采用PCR方法從單核細(xì)胞增生性李斯特菌LM4基因組中擴(kuò)增出prfA基因的同源臂片段prs和pi

3、cA。采用SOEing PCR方法將prs、plcA基因連接起來(lái)，將連接片段prs/plcA與pMD18-T載體相連并測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切回收后插入穿梭載體pKSV7中，構(gòu)建成重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-prs/plcA。將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到LM4中，在溫度和氯霉素抗性雙重選擇壓力下傳8代進(jìn)行同源重組，然后在無(wú)選擇壓力下傳10代將質(zhì)粒丟失，最終獲得prfA基因缺失的菌株LM4△prfA。在LM4△prfA的回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)中，將pefA基因擴(kuò)

4、增出來(lái)并連接到表達(dá)載體pERL3質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到DH10β中進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到LM4的prfA基因缺失株中，獲得LM4△prfA的回復(fù)突變株。
　　 2、單核細(xì)胞增生性李斯特菌PrfA的生物學(xué)功能的研究
　　 在獲得LM4△prfA的基礎(chǔ)上，對(duì)PrfA的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。突變株與其親本株的生長(zhǎng)曲線、生理生化特性、對(duì)藥物的藥敏性無(wú)顯著差異，表明PrfA對(duì)生長(zhǎng)代謝的影響作用不顯著。溶血實(shí)驗(yàn)中LM4的溶血效價(jià)為2

5、4，LM4△prfA的溶血效價(jià)為0，突變株喪失溶血能力，而prfA回復(fù)突變株的溶血活性得以完全恢復(fù)，表明PrfA對(duì)hly基因具有調(diào)控作用。肌醇磷脂酶與卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)中LM4的周圍均出現(xiàn)透明圈，而LM4△prfA沒有出現(xiàn)此現(xiàn)象，說明突變株細(xì)菌失去了磷脂酶活性。生物膜形成實(shí)驗(yàn)中，LM4的OD590值為0.8478，LM4△prfA的OD590值為0.6772，prfA缺失株與其親本株之間生物膜形成能力差異顯著(p<0.05)，表明prfA的缺

6、失可影響生物膜的形成。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，LM4的侵襲率為1.68％，LM4△prfA為0.38％，顯示突變株的侵襲力顯著下降(p<0.01)。對(duì)BALB/c小鼠的LD50實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變株的毒力較親本株下降了105個(gè)數(shù)量級(jí)，突變株毒力顯著降低。
　　 3、單核細(xì)胞增生性李斯特菌PrfA缺失株及其親本株分泌蛋白的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 本研究采用二維凝膠電泳(2-DE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定技術(shù)(MA

7、LDI-TOF-MS)，從蛋白質(zhì)水平上研究PrfA的調(diào)控功能。實(shí)驗(yàn)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)LM4及LM4△prfA，離心菌液并用三氯乙酸(TCA)對(duì)離心后的培養(yǎng)上清進(jìn)行沉淀，從而獲得分泌蛋白。二維凝膠電泳圖譜的差異表達(dá)分析顯示有31個(gè)點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定成功19個(gè)點(diǎn)，對(duì)應(yīng)12種蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)己知的毒力相關(guān)蛋白有InlC、ActA、LLO，此外還新發(fā)現(xiàn)了一些受PrfA調(diào)控的蛋白，包括丙氨酸丙氨酰羧肽酶、GW重復(fù)表面蛋白。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)蛋白