SigmaB基因缺失對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌致病性和環(huán)境應(yīng)激能力的影響.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽(yáng)性致病菌,生存能力強(qiáng),存在范圍廣。LM主要通過(guò)消化道引起動(dòng)物和人的急性感染,對(duì)畜牧業(yè)和人類健康造成了巨大的威脅,因此,LM被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)列為四大食源性致病菌之一。
　　作為一種典型的細(xì)胞內(nèi)寄生致病菌,LM能在專業(yè)和非專業(yè)吞噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖,可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫

2、,因而許多研究者希望通過(guò)改造LM的毒力基因,使其毒力降低,用作LM弱毒疫苗或抗病毒、抗腫瘤的疫苗活載體。然而,作為疫苗或疫苗活載體,必須要安全可靠。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)LM部分毒力基因進(jìn)行了改造,但未獲得預(yù)期的減毒效果。在LM中,σB因子由SigmaB基因編碼,是RNA聚合酶全酶中的一個(gè)亞基,研究表明σB因子對(duì)許多毒力基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)節(jié)作用,因此本研究通過(guò)基因缺失手段構(gòu)建SigmaB基因缺失株,為L(zhǎng)M弱毒疫苗和疫苗活載體研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。研

3、究方法和主要結(jié)果如下:
　　1.LM新疆野毒株XS5 SigmaB操縱子的克隆及序列分析
　　根據(jù)GenBank登錄的SigmaB操縱子序列,設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增LM新疆野毒株XS5 SigmaB操縱子基因片段,用DNAMAN軟件和在線軟件分析擴(kuò)增序列所含各基因編碼蛋白的活性位點(diǎn)和高級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果成功擴(kuò)增出3000bp的SigmaB操縱子片段,該序列含有rsbV、rsbW、rsbX和SigmaB四個(gè)基因,其中SigmaB基因全

4、長(zhǎng)801bp,編碼265個(gè)氨基酸,8到264位AA為RNA聚合酶全酶中的σB因子區(qū)域,41到110位AA為Sigma70_r2超家族,是整個(gè)蛋白質(zhì)中最保守的區(qū)域。SigmaB基因同源性分析顯示,在LM不同菌株之間SigmaB基因的同源性較高,表明該基因具有較高的保守性。
　　2.LM-XS5-△SigmaB缺失株的構(gòu)建與分子鑒定
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)一獲得的SigmaB操縱子測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)融合PCR引物,運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)獲得缺失

5、SigmaB基因的融合PCR產(chǎn)物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-ΔSigmaB,測(cè)序。構(gòu)建重組穿梭載體pKSV7-ΔSigmaB。用電擊轉(zhuǎn)化的方法將重組穿梭載體轉(zhuǎn)入LM-XS5感受態(tài)細(xì)胞,用PCR方法篩選和鑒定重組菌。結(jié)果成功構(gòu)建了SigmaB基因缺失株(LM-XS5-△SigmaB)。重組缺失株P(guān)CR鑒定條帶與預(yù)期缺失后的值1502bp相符,測(cè)序結(jié)果證實(shí)成功缺失了LM-XS5的SigmaB基因。經(jīng)過(guò)25代的連續(xù)傳代,PCR鑒定結(jié)果顯示,

6、該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　3.SigmaB基因缺失對(duì)LM致病性和環(huán)境應(yīng)激能力的影響
　　將野毒株LM-XS5和實(shí)驗(yàn)二構(gòu)建的SigmaB基因缺株LM-XS5-△SigmaB于相同條件下培養(yǎng)后,分別感染巨噬細(xì)胞RAW264.7和BALB/C小鼠,通過(guò)單菌落計(jì)數(shù)、存活小鼠的統(tǒng)計(jì)以及Real-time RT-PCR毒力基因表達(dá)量檢測(cè)的方法來(lái)對(duì)比缺失株與野毒株的致病性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與野毒株相比,SigmaB基因缺株的粘

7、附率和侵襲率均下降(p<0.05);肝、脾載菌量減少(p<0.05);LD50升高了2.60個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí);被檢測(cè)的毒力基因表達(dá)量均降低。結(jié)果表明缺失SigmaB基因使LM的致病性減弱。用單菌落計(jì)數(shù)的方法對(duì)比缺失株與野毒株在高溫、高滲透壓和酸堿環(huán)境中應(yīng)激能力的差異,使用Real-timeRT-PCR的方法檢測(cè)環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野毒株相比,SigmaB基因缺失株在不同應(yīng)激環(huán)境中的活菌數(shù)明顯減少;對(duì)環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因(rsb