單核細(xì)胞增多性李斯特菌分子進(jìn)化與酸應(yīng)激功能基因組學(xué)研究.pdf

1、本研究旨在探明:(1)國內(nèi)食源性單增李斯特菌的分子流行病學(xué)特征與致病性；(2)單增李斯特菌譜系Ⅲ和無害李斯特菌的生物多樣性及其分子進(jìn)化關(guān)系；(3)單增李斯特菌精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)的抗酸應(yīng)激功能及其分子機(jī)制。1、食源性單增李斯特菌分子流行病學(xué)特征與致病性
　　 所有ⅢA-1、ⅢA.2、ⅢB與ⅢC菌株均具有與譜系Ⅰ和Ⅱ強(qiáng)毒株相似的胃液存活力、細(xì)胞黏附力、侵襲力以及細(xì)胞空斑形成能力,對正常小鼠與免疫抑制小鼠均具有致病力。但ⅢA-3在胃液

2、的存活力僅為其他菌株的1/1000,在慶大霉素存在時不能形成細(xì)胞空斑,易被宿主清除,因而對正常小鼠與免疫抑制小鼠的致病力均很弱。所有譜系Ⅲ菌株均含有完整的LIPI-1、InlAB等毒力因子,其余內(nèi)化素(如InlC、InlF、InlJ)及ActA中一個PRR重復(fù)區(qū)的缺失并不是導(dǎo)致ⅢA-3弱毒的因?yàn)椤＂驛-3菌株的LIPI-1毒力基因與inlAB的表達(dá)水平顯著高于其他菌株,具有極強(qiáng)的體外溶脂活性。在ⅢA-3的PrfA轉(zhuǎn)座突變株中,LIPI-

3、1毒力基因與inlAB的表達(dá)量降至親本株的1/10～1/1000。因此,ⅢA-3的毒力基因高水平表達(dá)可能由PrfA的過度表達(dá)引起。PrfA是單增李斯特菌最重要的毒力調(diào)控因子,ⅢA-3的PrfA第145位由甘氨酸(G)突變?yōu)榻z氨酸(S)。該位點(diǎn)位于PrfA的HTH基序外側(cè),其突變引起PrfA空間構(gòu)象改變而處于構(gòu)成性激活狀態(tài),引起下游調(diào)控基因(包括膜裂解因子LLO、PC-PLC等)過度表達(dá),細(xì)菌裂解宿主細(xì)胞的能力增強(qiáng),從而使菌體暴露于機(jī)體免

4、疫系統(tǒng)而被清除,進(jìn)而導(dǎo)致弱毒。其余譜系Ⅲ菌株均為強(qiáng)毒株,但極少引起人發(fā)病,可能是因其在食品與環(huán)境中的分離率較低,感染人的幾率較小。
　　 ⅢA-3代表菌株M7的全基因組序列長2852640bp,編碼約2970個ORF,GC含量為38.2％,高于其他譜系(37.8～38.0％)。與1/2a型、4b型強(qiáng)毒株相比,M7在46個區(qū)域缺失109個基因,包括ADI基因島(lmo0036-lmo0041基因簇)、rplS-infC內(nèi)化素島、a

5、scB-dapE內(nèi)化素島及11個疑似轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等。M7含有345個特異性基因,包括E家族毒力因子M7-28、Sigma家族蛋白M7-210、內(nèi)化素M7-214與4個疑似轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等。Ⅲa-3含有與強(qiáng)毒株相同的LIPI-1,但其23S rRNA與無害李斯特菌具有更高的同源性?；?168個李斯特菌屬保守基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹中,ⅢA-3位于單增李斯特菌譜系Ⅰ、Ⅱ與無害李斯特菌之間。ⅢA-3既含有單增李斯特菌特異的毒力因子(如LIPI-1、I

6、nlAB、Bsh等),又與無害李斯特菌具有相似的基因缺失(如精氨酸脫亞胺酶基因島、rplS-infC內(nèi)化素島、ascB-dapE內(nèi)化素島等)與基因插入(108個共有特異性基因),這類弱毒株可能為單增李斯特菌-無害李斯特菌進(jìn)化枝的進(jìn)化中間體。ⅢA-3特異性含有介導(dǎo)細(xì)菌水平轉(zhuǎn)移的多種噬菌體相關(guān)蛋白、重組酶、整合酶、轉(zhuǎn)座子蛋白與CRISPR相關(guān)蛋白,提示ⅢA-3可能具有更高的水平轉(zhuǎn)移發(fā)生概率。但是,ⅢA-3無法指示該進(jìn)化枝的進(jìn)化方向。無害李斯

7、特菌作為進(jìn)化枝的另一極,其亞群結(jié)構(gòu)可能為確定該進(jìn)化枝的進(jìn)化方向提供重要線索。3、無害李斯特菌的亞群結(jié)構(gòu)以及單增李斯特菌.無害李斯特菌分枝的進(jìn)化關(guān)系
　　 亞群D對應(yīng)于內(nèi)化素型5,在進(jìn)化樹上偏離其他亞群,可能是單增李斯特菌與無害李斯特菌的另一進(jìn)化中間體?？赏ㄟ^丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶與丙氨酸芳胺酶反應(yīng)活性與無害李斯特菌其他亞群相區(qū)別。較之亞群A菌株CLIP11262,L43在全基因組的50個區(qū)域缺失365個基因。其中部分為L

8、43與單增李斯特菌共同缺失,部分為進(jìn)化中間體L43與單增李斯特菌ⅢA-3特異缺失。L43含有單增李斯特菌特異性黏附因子InlJ,但在第11個賴氨酸重復(fù)區(qū)具有7個核苷酸的錯位缺失,代表首例提前終止的InlJ。
　　 綜上所述,提出單增李斯特菌.無害李斯特菌進(jìn)化枝的進(jìn)化模型。單增李斯特菌1/2c型(譜系Ⅱ)代表最古老的類群,存在至少3條進(jìn)化途徑:一條進(jìn)化為譜系Ⅰ,經(jīng)1/2b至4b；一條通向ⅢB(由ⅢB-1至ⅢB-2):另一條則進(jìn)化為

9、1/2a型(譜系Ⅱ)和ⅢA-1/-2,后者進(jìn)而分化為ⅢA-3與ⅢC(ⅢC-1至ⅢC-2)。單增李斯特菌ⅢA-3為進(jìn)化中間體,并經(jīng)由另一進(jìn)化中間體無害李斯特菌亞群D,向無害李斯特菌進(jìn)化(由亞群C至亞群A、B)。4、單增李斯特菌酸應(yīng)激功能基因組學(xué)研究
　　 無論從分子進(jìn)化或功能基因組學(xué)角度,ADI基因簇均引起了我們的關(guān)注。該基因島含有8個基因,包括arc家族成員arcABCD、aguA家族成員aguA1與aguA2、可能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

10、lmo0041與未知功能基因lmo0042,同時涵蓋ADI系統(tǒng)與AgDI系統(tǒng)。這些基因在酸性條件(pH4.8)的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于中性條件(pH7.0)。這些基因缺失株在中性BHI(pH7.0)的生長速率與親本株無差異,但在酸性BHI(pH5.5)的生長速率低于親本株；這種生長差異在酸性MEM(pH5.5)中更為明顯。在人工胃液中,各缺失株的存活率亦顯著低于親本株。表明ADI系統(tǒng)是單增李斯特菌的抗酸應(yīng)激系統(tǒng)。同時,各缺失株對小鼠的致病力

11、顯著低于親本株。aguA1與aguA2編碼雙拷貝的鯡精胺脫亞胺酶(AgDI),但aguA2對單增李斯特菌的抗酸性發(fā)揮更重要的作用,對致病力的影響亦更為明顯。5、單增李斯特菌精氨酸脫亞胺酶/鯡精胺脫亞胺酶系統(tǒng)功能蛋白的作用機(jī)制
　　 單增李斯特菌arcA(lmo0043)編碼ADI,以精氨酸為反應(yīng)底物。單增李斯特菌含有arg基因家族,可內(nèi)源性合成精氨酸；又可在強(qiáng)酸性環(huán)境中攝取外源性精氨酸。精氨酸經(jīng)ADI催化發(fā)生脫亞胺反應(yīng),生成瓜氨

12、酸與氨。同時,aguA1(lmo0038)與aguA2(lmo0040)編碼雙拷貝的鯡精胺脫亞胺酶(AgDI),以鯡精胺為底物。單增李斯特菌可在強(qiáng)酸性環(huán)境中攝取外源性鯡精胺；又具有精氨酸脫羧酶活性,可介導(dǎo)精氨酸的脫羧反應(yīng)生成內(nèi)源性鯡精胺。鯡精胺經(jīng)AgDI催化發(fā)生脫亞胺反應(yīng),生成氨甲酰腐胺與氨。AguA1與AguA2具有相似的親水性與活性位點(diǎn),但AguA2對單增李斯特菌的抗酸性具有更顯著的影響。由此可見,ADI與AgDl分別啟動了其相應(yīng)的

13、代謝通路。
　　 ArcB兼具鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC)與腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)的活性,催化兩組可逆的氨甲?；D(zhuǎn)移反應(yīng),為首例可同時催化4個反應(yīng)方向的氨甲酰轉(zhuǎn)移酶。體外的轉(zhuǎn)氨甲酰反應(yīng)平衡傾向于同化方向。同化反應(yīng)的最適pH呈堿性(pH8～pH10),而異化反應(yīng)的最適pH為酸性(pH5～pH5.5),提示OTC/PTC在酸性環(huán)境(如胃液)中主要催化異化反應(yīng)。異化方向OTC催化瓜氨酸的脫氨甲酰反應(yīng),生成鳥氨酸與氨甲酰磷酸鹽；而異

14、化方向PTC則催化氨甲酰腐胺的脫氨甲酰反應(yīng),生成腐胺與氨甲酰磷酸鹽。OTC與PTC活性分別推進(jìn)了ADI代謝通路與AgDI代謝通路。ArcB將這兩條代謝通路聯(lián)系起來,發(fā)揮承前啟后的關(guān)鍵作用。
　　 氨甲酰磷酸鹽在氨甲酰激酶CK(lmo0039)的作用下,生成二氧化碳與氨。而鳥氨酸與腐胺通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)因子AP(Imo0037),與胞外的精氨酸或鯡精胺進(jìn)行等量交換,啟動新一輪的ADI與AgDI代謝循環(huán)。該循環(huán)處于動態(tài)平衡之中。在1個AD

15、I或AgDI循環(huán)中,1 mol精氨酸或鯡精胺生成2 mol氨。在酸性環(huán)境中,氨與細(xì)胞質(zhì)中的H+結(jié)合為NH4+,提高細(xì)胞質(zhì)的pH,以減輕酸應(yīng)激對細(xì)胞的傷害,從而增強(qiáng)細(xì)菌在酸性環(huán)境(如胃液)中的存活力。
　　 ADI基因島如此精巧的排布背后,必然有一個縝密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。Lmo0041屬于rpiR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,ArgR為精氨酸合成抑制因子,分別在胃液中負(fù)調(diào)控與正調(diào)控ADI與AgDI代謝通路,其中Lmo0041的作用強(qiáng)于ArgR。

16、ArgR同時正調(diào)控Lmo0041,更加劇了Lmo0041對ADI與AgDI通路的負(fù)調(diào)控作用。ADI基因島中存在應(yīng)激調(diào)控因子SigB與毒力調(diào)控因子PrfA的結(jié)合位點(diǎn),提示ArgR與Lmo0041可能受更高一級的調(diào)控因子所調(diào)控。這些調(diào)控因子可能在不同的環(huán)境條件下,選擇性激活或抑制ADI與AgDI代謝通路。由此可見,ADI與AgDI系統(tǒng)在級聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用下,介導(dǎo)單增李斯特菌的抗酸性以及致病力。
　　 綜上所述,本論文闡明了(1)國內(nèi)

17、外食源性單增李斯特菌(除譜系Ⅲ菌株M7)均具有較強(qiáng)的致病力,進(jìn)口水產(chǎn)品中單增李斯特茵的危害風(fēng)險性高于我國食品體系；(2)單增李斯特菌譜系Ⅲ具有極高的生物多樣性,亞系ⅢA-3菌株為弱毒,可能由毒力調(diào)控因子PrfA的第145位氨基酸發(fā)生突變引起；(3)無害李斯特菌代表相對年輕的種,包含4個亞群,其中亞群A代表環(huán)境適應(yīng)性的進(jìn)化方向,亞群D與單增李斯特菌ⅢA-3構(gòu)成單增李斯特菌-無害李斯特菌進(jìn)化枝的進(jìn)化中間體,該進(jìn)化枝代表細(xì)菌致病力由強(qiáng)變?nèi)醯暮?/p>