單核細胞增多性李斯特菌溶血素LLO的功能關(guān)鍵位點鑒定及表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM），簡稱單增李斯特菌，是一種革蘭氏陽性、食源性胞內(nèi)病原菌。LM主要通過分選酶（Sortase）系統(tǒng)將含有LPXTG基序的蛋白錨定至胞壁并發(fā)揮相應功能。溶血素Listeriolysin O（LLO）是屬于依賴于膽固醇的膜穿孔蛋白家族（CDCs），在游離狀態(tài)下可以形成直徑35 nm的孔狀結(jié)構(gòu)，插入到宿主細胞膜內(nèi)，在李斯特菌逃離到細胞質(zhì)中扮演著重要的角色。
　　本

2、研究分別以單增李斯特菌參考菌株EGD-e和弱毒株M7溶血素蛋白（Listeriolysin O，LLO）為研究對象，通過同源重組及氨基酸突變技術(shù)將編碼LLO蛋白的基因hly在基因組水平上進行如下修飾：（1）構(gòu)建LLO缺失突變株（ΔLLO）；（2）將野生株LLO蛋白第472-483位氨基酸缺失，使其形成攜帶LPXTG基序的重組LLO菌株（LLOLPXTG）。Western blot試驗結(jié)果顯示EGD-e和M7菌株缺失LLO后均未檢測到LL

3、O蛋白的表達，而LLOLPXTG缺失株檢測到重組LLO蛋白的表達，證實ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株均構(gòu)建成功；鼠源巨噬細胞RAW264.7胞內(nèi)增殖試驗表明，EGD-e的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的胞內(nèi)增殖力顯著減弱；溶血試驗表明，M7的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的溶血活性完全喪失。體外原核表達純化LLO及其第472-483位氨基酸突變體蛋白，并研究其體外溶血活性。結(jié)果顯示只有LLO第478和479位氨基

4、酸影響LLO的溶血活性。體內(nèi)外試驗表明單增李斯特菌LLO蛋白與細菌感染宿主細胞后的增殖能力密切相關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實LLO第472-483位氨基酸為其關(guān)鍵位點，決定了LLO的活性及功能。LLO缺失株的構(gòu)建可以為細菌體內(nèi)表面展示技術(shù)在宿主細胞內(nèi)進行抗原展示和遞呈的研究奠定重要基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實單增李斯特菌LLO第472-483位氨基酸為其關(guān)鍵位點或功能域，決定了LLO的活性及功能；單增李斯特菌LLOLPX