單核增生性李斯特氏菌溶血素分段表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種人畜共患的病菌，并且是重要的食源性病原微生物之一，分布廣泛，易感人群較多，可引起人類和動(dòng)物的敗血癥、流產(chǎn)、腦膜炎和胃腸炎等臨床癥狀。其中hly基因是李斯特菌的重要的毒力基因，hly編碼形成的蛋白大小約為60ku，稱為溶血素(LLO)，李斯特菌溶血素能溶解多數(shù)哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞，是一種孔形成毒素，能協(xié)助LM進(jìn)入靶細(xì)胞，及逃逸吞噬小體。
　　 本實(shí)驗(yàn)在生

2、物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，參照hly全基因序列設(shè)計(jì)五對(duì)特異性引物，應(yīng)用PCR擴(kuò)增產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的溶血素基因hly，獲得大小分別約為1600bp、980bp、675bp、540bp、620bp的目的片段，并pMD18-T Simple載體連接，經(jīng)酶切、PCR鑒定、測(cè)序鑒定。該基因片段與pET30b表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ處理后進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。通過酶切、PCR鑒定及序列測(cè)定后，嘗試誘導(dǎo)表達(dá)，并保存獲得的陽(yáng)性表達(dá)重組

3、質(zhì)粒，表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)分段表達(dá)的蛋白全部是以包涵體形式表達(dá)，所以嘗試將重組質(zhì)粒與分子伴侶質(zhì)粒pG-KJE8共同轉(zhuǎn)化到BL21中，并用終濃度為1mg/ml L-阿拉伯糖和0.2mmol/L的IPTG進(jìn)行分步誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明利用分子伴侶的共表達(dá)系統(tǒng)，其中重組李斯特菌溶血素蛋白以可溶形式表達(dá)。應(yīng)用可溶形式表達(dá)的李斯特菌溶血素蛋白進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有溶血活性，但是將重組LLO蛋白進(jìn)行純化后免疫BALB/c小鼠，收集陽(yáng)性血

4、清進(jìn)行Western blot及ELISA分析后發(fā)現(xiàn)并不與LM分泌的天然LLO發(fā)生特異性結(jié)合。對(duì)LM培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在60ku大小存在目的蛋白，并通過溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證此蛋白為L(zhǎng)LO蛋白，將LM上清液進(jìn)行過濾除菌后將其用PEG20000進(jìn)行濃縮，并用甲醛37℃滅活脫毒后，免疫BALB/c小鼠，免疫兩周后的第7天，將LM上清液進(jìn)行稀釋后，利用間接ELISA方法確定抗原與血清最佳工作濃度。
　　 細(xì)胞融合后，應(yīng)用建

5、立間接ELISA方法將LM上清液稀釋16倍進(jìn)行包被后，對(duì)單抗進(jìn)行篩選。最終經(jīng)過三次克隆化，成功得到3株雜交瘤細(xì)胞，分別命名為5E3、3G7、4B7。這3株雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌抗溶血素(LLO)的單克隆抗體。亞類鑒定結(jié)果5E3、3G7、4B7分泌的單克隆抗體都為IgG1型，Westem blot檢測(cè)該單克隆抗體具有很好的反應(yīng)特異性。經(jīng)連續(xù)30代傳代，凍存復(fù)蘇后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，存前后OD值相差不大，說明這3株雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定分泌特異性