產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌hly和actA基因的原核表達(dá)及其產(chǎn)物的單克隆抗體研制.pdf

1、揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌hly和actA基因的原核表達(dá)及其產(chǎn)物的單克隆抗體研制姓名：董慧申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：焦新安20060501赫弼走學(xué)嬡士學(xué)篷速文二、LLO單克隆抗體的制蠢與鑒定誘導(dǎo)鶯組大腸桿諮BL21(pGEX6p1hly)，對(duì)全菌蛋宦避行SDSPAGE電泳，切割表達(dá)GSTLLO的目的條帶，研磨粉碎后免疫BALB／c小鼠，1001xg／P，腹腔注瓣，霹舔憊兩囂，共免疫3次。融臺(tái)囊謄3天綾縫純雖鑫G

2、s謄毛己0露靜躲熱強(qiáng)兔痰，7／ag／只。按常規(guī)稷序融合，純化蛋白GSTLLO、GST作為梭測(cè)抗原；間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆，軟得3株穩(wěn)定分泌LLOMcAb的細(xì)胞株，命名為386、4D1、5D10，腹承散價(jià)分鄹舞2105、210’、l105。McAb弱抗體疆類(lèi)溺定埒為IgGl。溶血抑制試驗(yàn)表明3株單抗均能抑制LLO介母的溶解小鼠紅細(xì)胞的能力。DotELISA試驗(yàn)表明：3攮零撬其與表達(dá)GS孓LL0載重組大嬲耪蘸以及￡掇分離株反應(yīng)，與其

3、它菌株不反應(yīng)。Westernblot試驗(yàn)中，3株革抗均能與融合蛋白0STLLO發(fā)生反應(yīng)，土；現(xiàn)特異性條帶，而與純化蛋白GST不反應(yīng)。LLO特異性單究隆抗體瓣成功磣稍，為研究LLO竣及蕊醇激活縋緇麓溶素家族葵經(jīng)藏爨的生物舉特性、控制Lm的致病性，以及建立快速檢測(cè)Lm的方法奠定了基礎(chǔ)。三、AetA蛋自擎憲隆抗體酶翻備與簽定應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜突瘤技術(shù)，以重組菌BL21(DE3)(pETactA)表達(dá)產(chǎn)物HisActA臻鑫免疫8羯耱BALB／e小鼓

4、，竣駐注瓣，lG0耀，只，善受露，菝擐與等量弗囂寵全佐劑混合乳化；二免、三兔時(shí)抗原與等量不完全弗氏佐劑混合乳化，間隔為兩髑；尾靜脈加強(qiáng)免疫不加佐劑的抗原，100tgJ只，3d后，取免疫鼠膊細(xì)胞和骨髓瘸sp2／o—Ag14細(xì)胞遴行融合。筑純酶GSTActA俸為檢測(cè)藏原，嗣聞接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆，獲得4株穩(wěn)定分泌ActAMcAb的細(xì)胞株，命名為1A5、2A2、3G1l、6F5，黢承匏皴徐蘞次必lt0’、5104、lxl05、5l礦。

5、滁2A2McAb濺類(lèi)為IgM外，其余均為IgGl。Dot—ELISA試驗(yàn)表明，4株革抗只與表達(dá)HisActA及GSTActA的重組大腸桿菌反應(yīng)，與其它菌株不反應(yīng)。Westernblot試驗(yàn)顯示4糠莘蕕筠麓與敲合鬣鑫His—ActA及GSTActA發(fā)篁三反應(yīng)，窶纜特異鏈條繁。MeAb1A5、2A2、3G11、6F5是針對(duì)ActA的特異性單克隆抗體，它們?cè)谘芯緼ctA的生物學(xué)功能、Lm茲致瘸性以及撼示細(xì)菌艦動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)機(jī)制等方題具有重鬟鵲應(yīng)用