單核細(xì)胞增多性李斯特菌精氨酸和鯡精胺脫亞胺酶的抗酸應(yīng)激機制及其調(diào)控.pdf

1、單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是革蘭氏陽性、胞內(nèi)寄生菌，廣泛存在于水、土壤、食品加工環(huán)境等;能引起人或動物感染。人多因食用受其污染的食品發(fā)病，免疫力低下、孕婦和嬰兒多發(fā)，可以引起腦膜炎、流產(chǎn)和敗血癥等，死亡率高達(dá)30％。2011年，美國共有28個州的147人因為食用污染李斯特菌的香瓜而引起的李斯特菌病，死亡30人。1964以來，我國大部分省份有零星的臨床病例報告。
　　LM感染宿主過程

2、的每一步受特定毒力因子或調(diào)控蛋白的控制，主要包括黏附侵襲因子inlA和inlB、細(xì)胞間遷移因子ActA、PrfA調(diào)控子、SigB調(diào)控子等。在應(yīng)激條件下，LM會啟動一系列機制來應(yīng)對包括食品在內(nèi)的外環(huán)境和體內(nèi)感染過程所遭受到的不利因素，尤其是酸性環(huán)境應(yīng)激，如酸性發(fā)酵食品、胃酸以及宿主細(xì)胞吞噬體內(nèi)低pH等。耐酸應(yīng)激機制是其在酸性環(huán)境中持續(xù)生存的重要基礎(chǔ)，也可能是成功建立感染的前提。LM擁有谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)(GAD)，在酸性條件下細(xì)胞內(nèi)谷氨酸與

3、質(zhì)子結(jié)合形成γ-氨基丁酸，使胞內(nèi)質(zhì)子濃度降低;LM的F0F1-ATPase也參與維持細(xì)胞內(nèi)pH(pHi)的穩(wěn)態(tài)。本實驗室前期分析表明，LM還擁有精氨酸脫亞胺酶(ADI)和鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)系統(tǒng)，在其他細(xì)菌中這些酶類催化形成的NH3分子可與質(zhì)子結(jié)合調(diào)節(jié)pHi。但這些酶在LM抗酸應(yīng)激中是否發(fā)揮作用、如何發(fā)揮作用、其表達(dá)受哪些基因調(diào)控等方面鮮見報道。
　　本研究旨在探明:(1)精氨酸脫亞胺酶在LM抗酸應(yīng)激中的作用及其與致病力關(guān)系

4、;(2)鯡精胺脫亞胺酶在LM抗酸應(yīng)激中的作用機制;(3)精氨酸抑制因子ArgR對SigB和ADI系統(tǒng)的調(diào)控機制。
　　1.單核細(xì)胞增多李斯特菌胞內(nèi)pH測定方法及其應(yīng)用
　　本研究采用羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)建立了LM胞內(nèi)pHi的快速熒光檢測法，范圍在5.5-8.5的pH與435 nm和490 nm波長光激發(fā)后在535 nm處發(fā)射光強度的比值（熒光比率Ratio490/435）有很高擬合度(R2＞0.99

5、)，說明Ratio490/435值變化反映菌體內(nèi)pHi，應(yīng)用該方法研究了不同LM菌株在無機酸和有機酸應(yīng)激條件下的pHi變化趨勢。在胞外pH(pHex)為5.5的有機酸應(yīng)激條件下，3個LM菌株在20-30min內(nèi)pHi略有下降，此后恢復(fù)至正常水平;在 pHex為4.5時，醋酸(AA)和乳酸(LA)應(yīng)激60min后的pHi仍不見恢復(fù)，而檸檬酸(CA)應(yīng)激30min后則見pHi恢復(fù)，鹽酸(HA)應(yīng)激對pHi的影響最小。
　　2.單核細(xì)胞

6、增多性李斯特菌的抗酸應(yīng)激能力
　　pH5.5的有機酸和無機酸應(yīng)激顯著影響LM的生長，雖然對菌株M7生長的影響更為顯著，但該菌株在pH7.5培養(yǎng)基中的生長也不如其他3個菌株。在pH4.5條件下，除了無機酸HA和CA應(yīng)激組有3株受試菌株在培養(yǎng)數(shù)小時后略呈現(xiàn)生長態(tài)勢外，AA和LA應(yīng)激條件下的LM生長受到抑制，表明不同酸應(yīng)激對LM的生長抑制作用有一定的差異，AA和LA的作用強于CA和HA。不同酸應(yīng)激條件下LM生長受抑制的程度與上述pHi的

7、變化具有相關(guān)性。
　　pH3.5的不同酸處理對LM是致死性的，存活率由高到低依次為HA＞CA＞LA＞AA;相比而言，菌株M7的存活率最低。以pH2.5的人工胃液模擬宿主胃腸道環(huán)境，菌株M7同樣表現(xiàn)出最弱的存活能力（僅0.03％），顯著低于另3個菌株(1.17％-2.71％)。
　　3.單核細(xì)胞增多性李斯特菌精氨酸脫亞胺酶的抗酸應(yīng)激作用
　　LM的ADI（由arcA編碼）具備精氨酸脫亞胺酶家族經(jīng)典的空間結(jié)構(gòu)及保守的催化結(jié)

8、構(gòu)域和氨基酸位點，且有ADI酶活性。pH4.8的酸應(yīng)激可顯著提高arcA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。缺失arcA后的LM在pH5.5培養(yǎng)基中的生長顯著低于親本菌株(P＜0.01)，基因回補可恢復(fù)其對酸的抵抗能力。與野生株相比，arcA缺失株在pH2.5的人工胃液中的存活能力顯著降低(P＜0.05)。arcA缺失株口服灌胃感染ICR小鼠1h和2h胃中的存活細(xì)菌數(shù)均顯著低于野生株與回補株(P＜0.01)。靜脈注射感染小鼠48 h和72 h脾臟中的

9、細(xì)菌數(shù)顯著低于野生型菌株（Log10 CFU分別為4.1vs6.7和3.8 vs6.9，P＜0.01），基因回補株的脾臟菌數(shù)恢復(fù)至野生株水平。上述結(jié)果表明，LM的arcA編碼蛋白具備ADI活性，且介導(dǎo)細(xì)菌在酸環(huán)境中的生長或存活能力，亦與致病性相關(guān)。
　　4.單核細(xì)胞增多性李斯特菌雙拷貝鯡精胺脫亞胺酶AguA1和AguA2介導(dǎo)抗酸應(yīng)激差異的分子機制
　　LM含有雙拷貝的AgDI∶ AguA1和AguA2，分別由aguA1和ag

10、uA2編碼，兩者均具備與其催化活性相關(guān)的5個氨基酸活性位點(Cys356、Asp94、Asp218、His216和Glu155)。aguA1和aguA2在pH5.0酸應(yīng)激1h后的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（P＜0.05）。aguA1缺失株在pH2.5的人工胃液中存活力顯著低于野生株和回補株(P＜0.01)，而缺失aguA2對LM的存活能力無顯著影響(P＞0.05)，aguA1和aguA2雙缺失后的存活能力與aguA1缺失株相當(dāng)。aguA1缺失株

11、口服灌胃后1小時胃內(nèi)的存活細(xì)菌數(shù)顯著少于野生株與回補株(P＜0.01)，缺失aguA2后其存活細(xì)菌數(shù)沒有受到顯著影響(P＞0.05)。由此表明，雖然雙拷貝的鯡精胺脫亞胺酶AguA1和AguA2在酸應(yīng)激下轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，但只有AguA1介導(dǎo)LM在體外和體內(nèi)的抗酸應(yīng)激作用。
　　重組表達(dá)的AguA1能夠高效且特異性地催化鯡精胺，比活力高達(dá)2050.78U/mg，而AguA2無催化活性。AguA1的酶動力學(xué)參數(shù)Km、Vmax、kca

12、t和kcat/Km值分別為0.65±0.23mM、85.69±7.58μM/min、34.28±3.03min-1和5.30×104 min-1M-1，最佳反應(yīng)溫度25℃，最適反應(yīng)pH范圍比較寬泛，在pH3.5-10.5范圍內(nèi)均具有較高的反應(yīng)活性。AguA1對儲存溫度敏感，25℃中存放6小時后活力幾乎全部喪失。金屬離子Co2+、Cu2+和Zn2+對AguA1的活性具有不同程度的抑制效應(yīng)，其中Cu2+抑制最顯著，IC50（半數(shù)抑制濃度）僅

13、為0.026 mM。
　　AguA1的催化位點C356、D94、D218、H216以及E155中任意一位突變后其酶活性均完全喪失。將AguA2特異性差異位點突變?yōu)锳guA1中對應(yīng)的氨基酸（Y47F、C157G、F196L、N236 D和H360Q）后發(fā)現(xiàn)，AguA2天然無活性的原因主要是由于第157位Cys引起的，AguA2-C157G突變蛋白具有高活酶活;而將AguA1該位點進(jìn)行G157C突變，酶活性完全喪失。因此，本研究首次證

14、實LM雙拷貝鯡精胺脫亞胺酶AguA1和AguA2的生物學(xué)功能差異主要在于兩者第157位氨基酸位點。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)并證實除了C356、D94、D218、H216以及E155位點外，G157位點為新發(fā)現(xiàn)的LM-AgDI關(guān)鍵氨基酸，且同樣決定了其催化活性。
　　5.單核細(xì)胞增多性李斯特菌精氨酸抑制因子ArgR調(diào)控抗酸應(yīng)激機制
　　LM精氨酸抑制因子ArgR屬于ArgR/AhrC轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，參與精氨酸代謝的調(diào)控。ArgR與

15、其他同源蛋白的親緣性比較近，且存在該家族蛋白兩個重要的結(jié)構(gòu)域（啟動子結(jié)合區(qū)“SR”和精氨酸結(jié)合區(qū)“GTIAGDTT”）。ArgR與細(xì)菌的酸應(yīng)激存活能力密切相關(guān)，ArgR缺失后導(dǎo)致細(xì)菌在致死性酸應(yīng)激下的存活能力顯著增強（P＜0.01）。EMSA顯示，ArgR能夠與arcA、sigB、argC和argG啟動子區(qū)的ArgR box發(fā)生結(jié)合，結(jié)合能力存在明顯的差異，即argC≥argG＞ sig B＞ arcA。ArgR的“SR”氨基酸置換（S

16、42A和R43A）后與被調(diào)控基因啟動子的結(jié)合能力明顯減弱或喪失，證實這兩個位點為ArgR與啟動子結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。在pH5.5酸應(yīng)激顯著上調(diào)argR的轉(zhuǎn)錄水平，argR缺失顯著提高argG的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)量（包括報告基因gfp3的表達(dá)水平），表明其對精氨酸合成起負(fù)調(diào)控作用。酸應(yīng)激條件下argR缺失株的arcA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平顯著提高，同樣提高的還有sigB轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，初步表明ArgR也負(fù)調(diào)控精氨酸的分解代謝，但是由于arcA的表達(dá)同樣

17、受sigB正調(diào)控，ArgR對arcA的負(fù)調(diào)控并不一定是直接作用，可能是通過sigB起作用。當(dāng)添加外源性精氨酸后，argG在應(yīng)激和非應(yīng)激下的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)同樣受ArgR顯著抑制，而ArgR對sigB和arcA的抑制效應(yīng)卻解除。本研究表明ArgR在非應(yīng)激和酸應(yīng)激狀態(tài)下能夠反饋負(fù)調(diào)控精氨酸合成代謝通路基因argC和argG，且首次發(fā)現(xiàn)ArgR缺失能夠增強細(xì)菌的酸應(yīng)激存活能力，研究推測該變化是由于ArgR參與負(fù)調(diào)控抗酸應(yīng)激功能和調(diào)控基因（arcA和

18、sigB）的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)而引起。
　　綜上所述，本研究探明了LM的arcA基因編碼產(chǎn)物具有ADI酶活性，aguA1編碼產(chǎn)物具有AgDI酶活性;新發(fā)現(xiàn)了第157位甘氨酸對酶活性的重要作用，將AguA2的第157位氨基酸進(jìn)行C157G突變后即具有高酶活;ADI和AgDI均介導(dǎo)LM的抗酸應(yīng)激作用及其在小鼠胃中的存活力;精氨酸抑制因子ArgR不僅負(fù)調(diào)控精氨酸合成代謝，對應(yīng)激調(diào)控因子SigB以及精氨酸脫亞胺酶ADI也具有調(diào)控作用，但其精確的調(diào)