基于納米材料和核酸探針的生物傳感方法研究.pdf

1、生物傳感是基于生物分子識別及其下游信號轉換，進行目標物檢測的一類分析方法，是分析化學與生命科學的交叉研究領域。比較其它分析方法，它有著不少的優(yōu)勢，特別是提高了分析速度和應用靈活性。隨著電子、微電子和機械系統(tǒng)的進步，便攜式、集成式傳感元件的開發(fā)，生物傳感方法研究有機會為醫(yī)療、環(huán)境保護、食品安全乃至公共安全等領域提供更多現(xiàn)場快速檢測技術，為公共健康與公共安全建立第一道防線。近年來，納米材料領域的研究不斷突破，核酸識別、核酸信號放大新技術的持

2、續(xù)發(fā)展，為構建高靈敏、高選擇性、快速高效的新型生物傳感器提供了更完美的設計思路，為生物傳感器實現(xiàn)不同分析靶標的現(xiàn)場快速檢測提供了更有力的平臺。本論文則基于當前熱點納米材料-安全環(huán)保的碳、硅納米材料發(fā)展了三個頗具醫(yī)學診斷應用前景的生物傳感器，其中有細胞信號通路重要蛋白酶-磷脂酶D的檢測，活細胞及亞細胞器的示蹤。首次報道非氧化石墨烯通過非共價生物功能化應用于生物傳感器，也是首次展示利用無毒納米材料對細胞能量工廠-線粒體的示蹤研究效果能夠堪比

3、有機染料。同時涉及其中的納米材料-非氧化石墨烯、硅量子點、碳量子點的生物功能化研究都各自有小小突破，為它們在生物傳感領域的進一步發(fā)展奠定了良好的基礎。本論文還基于核酸雜交技術和金屬離子介導的核酸偽雜交技術分別發(fā)展了針對生物體重要的癌癥標記物-小RNA(microRNA)和環(huán)境污染物-汞離子的檢測技術，并且對這兩種靶標都實現(xiàn)了高靈敏高選擇性的分析。所有研究具體內容如下所述:
　　為了進一步拓寬非氧化石墨烯在生物傳感領域的應用，在第2

4、章中發(fā)展了一種新穎的雙層磷脂膜修飾的非氧化石墨烯復合納米材料，它是通過非氧化石墨烯大面積雙面芳香環(huán)層和已合成的脂質體疏水烷烴夾層利用范德華力和疏水作用力形成的，并且這種非共價組裝過程不會破壞石墨烯片層的電子大共軛結構，使得該復合納米材料保留了非氧化石墨烯卓越的電學和光學性質，而表面修飾的磷脂膜層則能賦予非氧化石墨烯良好的生物相容性、親水性以及表面可控修飾性，為石墨烯的生物功能化提供了一個新的實用平臺，該復合納米材料由磷脂雙分子層和疏水的

5、還原石墨烯片組成，類似細胞膜的結構，通過利用熒光素標記的磷脂摻雜在復合納米材料中，發(fā)展出了一個檢測磷脂酶D活性的熒光生物傳感器。該生物傳感器具有高靈敏和寬檢測范圍的特性，其檢測下限低至0.010U/L，優(yōu)于以往報道的磷脂酶D分析方法，而且基于該分析模式是一步均相法，該生物傳感器有極好的適應性，操作簡易性，以及進一步實現(xiàn)高通量分析和實時監(jiān)測反應動力學的可能。
　　近年來，硅納米材料憑借它出色的光學、電學、力學性質，以及表面可控修飾，

6、可適應硅材料作為半導體材料的特殊應用吸引科學家們的關注，尤其是零維硅納米材料-硅量子點，基于硅材料本身無毒、化學惰性、生物相容性極好，非常適合生物傳感方法研究，特別是生物成像領域。在第3章中我們首先將電化學刻蝕法合成的硅點用雙氧水氧化鈍化，再用硅烷化試劑在有機相中進一步老化，轉入水相后通過碳二亞胺/硫代琥珀酰亞胺法(EDC/Sulfo-NHS)進行表面水溶性改性獲得最終的硅量子點，該硅量子點具有優(yōu)良的水分散性，強熒光性（量子產率30％）

7、，合適的尺寸（約4nm），非常適合作為熒光成像探針。此方法合成的硅點表面保留了一定數目的伯胺基團，可以被進一步功能化。研究中我們分別選用線粒體定位試劑三苯基膦和溶酶體定位試劑嗎啉通過EDC/Sulfo-NHS交聯(lián)法進行功能化，并通過雙光子熒光共聚焦成像證明其示蹤效果，實驗結果證明，通過和商品化的有機染料對比，硅量子點能準確、快速（約15min）對亞細胞器線粒體和溶酶體進行定位，且成像效果不遜于有機染料探針，此外線粒體會在細胞凋亡初期腫脹

8、變圓，通過誘導劑引發(fā)細胞開始凋亡，實時成像圖顯示了我們合成的功能化硅量子點能很好的表現(xiàn)出線粒體形狀變化，進行細胞早期凋亡的示蹤，表明所得的硅量子點是有潛質的生物成像探針。
　　不光是石墨烯，碳納米材料本身優(yōu)異的光學、電學性質和無毒、化學惰性、容易代謝等特性促使科學家們不斷開發(fā)其在生物、醫(yī)學領域的應用。為了拓寬熒光碳納米材料在生物成像領域的發(fā)展空間，在第4章中我們合成了一個雙層脂質體共價修飾的新型碳量子點，因為傳統(tǒng)一步法合成出的碳點

9、往往光學性質差強人意（量子產率通常低于3％），很多相關研究都著力于表面改性提高量子產率，例如通過氨基修飾的低聚PEG（分子量約1500）進行表面鈍化處理，實現(xiàn)光學性能提高（量子產率約10％），而我們則嘗試用相似分子量的磷脂代替氨基修飾的低聚PEG對碳點進行表面鈍化，首先通過傳統(tǒng)的硝酸回流法合成出碳點前體，再通過超濾裝置篩選出所需顆粒大?。ㄐ∮?0nm），同時合成好雙分子層脂質體。利用碳二亞胺/硫代琥珀酰亞胺法將二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺的氨基

10、末端和碳點表面因氧化產生的羧基官能團交聯(lián)獲得最終的碳量子點，該碳點熒光強度比同濃度的前體碳點高3倍，尺寸約5nm，表面包裹的脂質體雙分子層能賦予碳點優(yōu)異的生物相容性和表面可控修飾性。我們進一步探索了碳點在HeLa（宮頸癌）細胞中的雙光子熒光共聚焦成像效果，實驗證明碳點在細胞各個位置都有分布，說明該方法合成的碳點非常適合生物成像領域的應用。
　　汞是高毒的環(huán)境污染物，尤其是其具有高遷移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物鏈放大

11、性等特點，即便是極微量的存在于環(huán)境中，對動植物及人類的健康也是極大的威脅。在第5章中我們設計了一個非常新穎的，基于T-Hg2+-T配位化學原理，能高靈敏性、高選擇性的檢測Hg2+的電化學傳感器。這項技術的設計思路是鄰近的聚TDNA鏈之間在Hg2+介導條件下產生的協(xié)同效應。先是在金電極表面，通過Au-S共價鍵，有序地組裝上一層由8個堿基組成的全TDNA單鏈探針，且該探針末端標記了電活性物質二茂鐵，當沒有Hg2+存在時，電極表面的聚TDNA

12、單鏈探針都各自柔軟地趴在金盤表面，二茂鐵離金表面很近，電子發(fā)生傳遞，可檢測到二茂鐵的氧化還原電流;當Hg2+存在條件下，最相鄰的聚TDNA單鏈探針可以成對協(xié)同性地結合Hg2+，即電極表面的探針構象在Hg2+介導的T-T錯配情況下可由柔軟的單鏈結構變成相對剛性的類似雙鏈的結構，這個構象變換導致了二茂鐵遠離電極表面，電子傳遞受阻，檢測到的氧化還原電流大大減弱。通過電化學信號的變化可以判斷Hg2+的存在及定量分析。這個檢測機理已經得到毛細管電

13、泳及一系列電化學方法的充分驗證，并且實驗結果表明這個傳感器能在1nM-2μM之間高靈敏檢測Hg2+，檢測下限能到達0.5nM，優(yōu)于本文中介紹的其它檢測方法，并且這項技術表現(xiàn)出了優(yōu)異的選擇性，這是和傳統(tǒng)的電化學方法（陽極溶出分析法ASV）檢測Hg2+最大的區(qū)別，而且這個Hg2+傳感器所需試劑非常少、操作步驟很簡單又有著極好的再生性。如此經濟高效的電化學傳感器在實時現(xiàn)場監(jiān)測環(huán)境中Hg2+將有很好的應用前景。
　　MicroRNA(mi

14、RNA)在生物體內發(fā)揮著至關重要的調控功能，不僅對細胞的生長、分化和凋亡有著重要的影響，而且還與許多疾病有著密切的關系，研究者發(fā)現(xiàn)在白血病、結腸直腸癌、乳腺癌和心血管障礙等疾病中，相關的miRNA都異常表達。由于miRNA具有核酸序列短、含量少以及相互之間序列相似性等特點，分析測試有一定的挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的檢測方法有印記雜交技術、微陣列檢測技術、基于RCA信號放大的檢測技術、陽離子聚合物等。本論文第6章中將向大家報道一種基于雙重侵入式信號放

15、大技術(Invaderassay)高靈敏高選擇性檢測miRNA的方法。曾有研究小組基于侵入式信號放大技術檢測miRNA，但是都是將目標miRNA作為模板探針，對相似序列的miRNA不能實現(xiàn)很好的區(qū)分，我們則是將miRNA設計成第一重循環(huán)放大的侵入式探針，并且miRNA的存在不會立即形成侵入位點重疊結構，我們借鑒缺口連接PCR的原理，設計出miRNA的3'端距侵入位點數個核苷酸距離。當加入嗜熱性Taq聚合酶，和相應的核苷三磷酸，完全匹配的

16、miRNA成為引物開始從3'端開始聚合延伸，當聚合延伸到達信號探針和模板探針雜交區(qū)的第一對核苷酸（即侵入位點），將距信號探針侵入位點核苷酸和后一位（靠近3'端）的核苷酸之間磷酸骨架斷開，信號探針5'翹起一段離開，另一段也因雜交序列變短，與模板雜交穩(wěn)定性減弱并脫離模板，遂成為第二重循環(huán)放大的引物探針。第二重循環(huán)放大類似第一重循環(huán)，也是需要借助聚合的作用才能形成侵入式結構，進一步消弱了非特異性切刻作用，第二重循環(huán)的信號探針是5'標記熒光團熒