基于核酸探針構(gòu)型轉(zhuǎn)換的生物傳感放大技術(shù)研究.pdf

1、核酸適體是從人工構(gòu)建的隨機寡核酸文庫里篩選出來與配體高效、專一結(jié)合的DNA或RNA片段，這種篩選技術(shù)稱為“指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化”(SELEX)。適體能與靶物質(zhì)進行高度特異性的結(jié)合。核酸適體的成功問世，糾正了很久以來關(guān)于核酸只是遺傳信息存儲和轉(zhuǎn)運載體的看法。核酸適體能特異性地結(jié)合蛋白質(zhì)、多肽、有機物、金屬離子等多種靶物質(zhì)。相對于抗體，適體還有特異性高、親和力好、制備運輸簡便、目標(biāo)廣泛等優(yōu)點。
　　正因為適體這些獨特的優(yōu)點，適體作為

2、特異性的分子識別元件被廣泛應(yīng)用于生物傳感體系中。核酸適體生物傳感器(aptamer sensor)是一種能夠連續(xù)和可逆地進行分子識別的裝置?；驹頌榇郎y物質(zhì)通過具有分子識別功能的接受器時，固定在接受器上的親合配基與待測生物分子相互作用的瞬間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，經(jīng)過換能器，以電或光等方式輸出，經(jīng)過電子系統(tǒng)的放大處理和顯示，可以對待測物質(zhì)進行定性定量檢測。這些傳感體系靈敏、快速、選擇性好，但是單純利用適配體結(jié)合靶分子前后引起信號改變的檢測方法，

3、在提高靈敏度方面十分有限。為了實現(xiàn)對低濃度的目標(biāo)物進行高靈敏度檢測，我們對傳感體系進行了信號放大處理，本論文前兩部分內(nèi)容就是對適體檢測體系信號放大方法展開研究，后一部分研究核酸探針HCR放大技術(shù)。
　　第二章設(shè)計了一種基于KF聚合酶反應(yīng)的電化學(xué)適配體傳感器，聯(lián)合二茂鐵功能化寡聚核苷酸，成功地檢測了可卡因小分子。可卡因存在時，識別探針改變它的發(fā)卡構(gòu)象，形成三叉復(fù)合物。適配體-可卡因復(fù)合物3‘端單鏈部分與捕獲探針互補雜交。在聚合酶作用

4、下，以識別探針為模板，以捕獲探針為引物進行聚合延長反應(yīng)。二茂鐵標(biāo)記的dUTP聚合在新合成的互補探針中，達(dá)到信號放大的目的。
　　第三章設(shè)計了一種無標(biāo)記，自鎖式雙功能寡聚核苷酸探針，用于不同的疾病標(biāo)記物的平行檢測。兩種基于等溫循環(huán)鏈置換聚合反應(yīng)(CNDP)和循環(huán)非核酸目標(biāo)置換聚合反應(yīng)(CCDP)的信號放大技術(shù)分別用于檢測p53基因和PDGF-BB。在目標(biāo)物存在的情況下，雙功能探針與目標(biāo)物形成一個三叉復(fù)合物，解開其中一個莖干的自-互補

5、部分，釋放出與引物互補的片段，引發(fā)等溫聚合取代反應(yīng)。產(chǎn)生大量的聚合產(chǎn)物，通過雙鏈插入劑SYBR Green I插入雙鏈DNAs，當(dāng)有單色光源的激發(fā)時，能發(fā)出放大的熒光，達(dá)到信號放大的目的。實驗結(jié)果證明基于等溫聚合取代反應(yīng)的雙功能探針檢測體系的有效性，且不需要化學(xué)標(biāo)記，具有設(shè)計彈性大、便捷性、簡單性和成本低的特點。
　　第四章提出了一種基于HCR放大反應(yīng)檢測DNA單堿基突變的電化學(xué)傳感器。實驗中設(shè)計的目標(biāo)鏈不僅與捕獲探針雜交，而且它