基于構(gòu)型轉(zhuǎn)換的功能核酸探針非標(biāo)記熒光法檢測重金屬離子和生物硫醇.pdf

1、隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快和人們生活水平的提高，環(huán)境污染問題和自身健康狀況受到了人們越來越多的重視，對有毒金屬離子及其一些疾病相關(guān)的生物活性小分子的分析檢測，在環(huán)境的監(jiān)控、疾病的預(yù)防診斷等領(lǐng)域有著非常重要的意義。
　　一些能與特定的靶分子特異性結(jié)合或者具有類似酶催化功能的特定功能性核酸的發(fā)現(xiàn)和一些特殊構(gòu)型核酸結(jié)構(gòu)功能的證實，突破了人們觀念中核酸只能作為遺傳物質(zhì)和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的認(rèn)識，已經(jīng)成功地用于環(huán)境、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域。功能性核酸主要經(jīng)體外篩選

2、的組合生物學(xué)技術(shù)和指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)獲得，具有特異性強(qiáng)、目標(biāo)物廣泛、易合成、易修飾、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點；在一定條件下，它會與目標(biāo)分子發(fā)生相互作用發(fā)生適應(yīng)性折疊形成的特定的構(gòu)型；這種生物識別機(jī)制及諸多優(yōu)點為設(shè)計簡單便捷、信號輸出靈活的傳感器提供平臺，在生化分析和臨床診斷中發(fā)揮了極大的作用。
　　本論文簡單介紹功能性核酸并綜述了功能核酸熒光傳感器在環(huán)境和生化分析中的相關(guān)研究應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合功能性核酸和非標(biāo)記型熒光生物傳感的優(yōu)

3、點，采用商業(yè)化、廉價的小分子染料核黃素和硫磺素T作為熒光指示劑，以目標(biāo)分子介導(dǎo)功能性核酸的構(gòu)型轉(zhuǎn)換為基礎(chǔ)，設(shè)計了兩種新型的非標(biāo)記型熒光傳感器用于金屬離子和生物小分子的檢測。具體研究工作內(nèi)容如下：
　　1.選用已經(jīng)商業(yè)化、相對廉價核黃素（riboflavin, Rf）作為熒光指示劑，以核黃素與 G-平面之間發(fā)生堆積作用導(dǎo)致熒光淬滅為基礎(chǔ)，利用富G序列的核酸適配體AGRO100為目標(biāo)靶的識別工具，構(gòu)建一種基于單鏈DNA和G-四鏈體間構(gòu)

4、型轉(zhuǎn)換的傳感體系。在無Pb2+存在時，核酸適配體AGRO100在處于單鏈自由態(tài)，不能有效地結(jié)合核黃素使其熒光猝滅；當(dāng) Pb2+存在時，AGRO100在 Pb2+的驅(qū)動下形成含有多個 G-平面的 G-四鏈體，進(jìn)而特異性結(jié)合核黃素使其熒光猝滅，使得核黃素的熒光明顯的降低，通過熒光降低的程度用來Pb2+的定量分析。在優(yōu)化的條件下，Pb2+濃度50-400 nM的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度的改變與Pb2+濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限達(dá)15 nM。在Na

5、SCN的輔助下，傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)特異性地檢測Pb2+。相比報道的鉛離子的測定方法，該傳感器不僅有設(shè)計簡單、操作方便、成本低廉、而且具有較高的靈敏度和選擇性。
　　2.選用具有誘導(dǎo)G-四鏈體形成并能與其結(jié)合產(chǎn)生熒光增強(qiáng)效應(yīng)的雙重功能性的有機(jī)小分子染料硫磺素 T(Thioflavin T，ThT)作為核酸構(gòu)象識別探針，利用 Hg2+離子能夠特異性地與 DNA序列上的 T結(jié)合形成 T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，以及Hg2+-S的強(qiáng)親和作用，以富G

6、、T堿基的單鏈DNA序列作為識別單元,建立一種雙輸出型的非標(biāo)記型熒光傳感器用于Hg2+和生物硫醇（Cys、GSH）的檢測。在無 Hg2+存在的情況下，ThT誘導(dǎo)富G、T的功能核酸AGRO100折疊形成 G-四鏈體，并與其結(jié)合生成 ThT-G-四鏈體復(fù)合物，產(chǎn)生顯著的熒光增強(qiáng)；當(dāng)有Hg2+時，強(qiáng)烈的 T-Hg2+-T作用使得AGRO100形成類發(fā)卡構(gòu)型的雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致ThT誘導(dǎo)的G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成被抑制，熒光現(xiàn)象也被關(guān)閉，以此用來實現(xiàn)Hg

7、2+的檢測；進(jìn)一步硫醇的存在，由于巰基汞結(jié)合物形成，功能核酸AGRO100恢復(fù)自由態(tài)，并在ThT的作用下再次形成ThT/G-四鏈體產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，以此信號來實現(xiàn)生物硫醇的測定。在優(yōu)化的條件下，ThT-AGRO100對低至50 nM的Hg2+產(chǎn)生熒光變化；ThT-AGRO100-Hg2+對Cys和GSH線性范圍分別是20.0 nM–2.5μM和30.0 nM–2.0μM，其檢測限達(dá)8.4 nM和13.9 nM，并將該傳感器成功用于血清樣品