基于核酸信號(hào)放大技術(shù)構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究.pdf

1、核酸信號(hào)放大技術(shù)是利用核酸擴(kuò)增、酶、脫氧核酶活性以及自組裝等技術(shù)，將靶標(biāo)分子轉(zhuǎn)化為大量的核酸分子的輸出，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子檢測(cè)的信號(hào)放大的核酸反應(yīng)體系。核酸信號(hào)放大技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域扮演著重要的角色，不但在核酸分析中受到廣泛的應(yīng)用，而且已經(jīng)拓展到免疫傳感器和適體傳感器中。合理運(yùn)用核酸信號(hào)放大策略不僅可以提高傳感器檢測(cè)的靈敏度，還可以簡(jiǎn)化傳感器的操作、節(jié)省分析時(shí)間、甚至提高選擇性。電致化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器具有操作簡(jiǎn)單、分析快速、

2、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具潛力的理想分析工具。本文從ECL技術(shù)依賴電化學(xué)界面的特點(diǎn)出發(fā)，設(shè)計(jì)適用于ECL技術(shù)的核酸信號(hào)放大策略，用于構(gòu)建操作便捷、成本低廉、響應(yīng)靈敏的ECL生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的超靈敏檢測(cè)，以滿足臨床診斷的需求。主要包括以下幾個(gè)方面的工作：
　　1.基于 phi29 DNA聚合酶調(diào)控的鏈置換擴(kuò)增構(gòu)建信號(hào)減小型 ECL生物傳感器檢測(cè)microRNA的研究
　　Phi29 DNA聚合酶

3、是一種具有高保真連續(xù)鏈置換聚合活性的高性能DNA聚合酶，有可能用于調(diào)控鏈置換擴(kuò)增(SDA)并克服傳統(tǒng)的 Klenow聚合酶不能用于長(zhǎng)鏈 DNA擴(kuò)增且復(fù)制易出錯(cuò)的問(wèn)題。本文研究了由phi29 DNA聚合酶調(diào)控的目標(biāo)誘導(dǎo)循環(huán)SDA并將其應(yīng)用于構(gòu)建信號(hào)減小型ECL生物傳感器檢測(cè)microRNA。目標(biāo)microRNA觸發(fā)phi29 DNA聚合酶調(diào)控的SDA可以產(chǎn)生大量單鏈DNA的輔助探針，生成的輔助探針與傳感界面修飾的捕獲探針、標(biāo)記有二茂鐵的探

4、針雜交形成三元“Y”型DNA結(jié)構(gòu)，以此引入猝滅劑二茂鐵，使得ECL信號(hào)減小，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)microRNA的定量分析。由于引入目標(biāo)物引發(fā)循環(huán)SDA的高效信號(hào)放大技術(shù)，該生物傳感器檢測(cè) miRNA-21的靈敏度得到顯著的提高，其線性范圍為10 amol·L-1到1.0 pmol·L-1，檢測(cè)限低至3.3 amol·L-1。
　　2.基于目標(biāo)物循環(huán)同步滾環(huán)擴(kuò)增信號(hào)放大策略構(gòu)建ECL生物傳感器檢測(cè)microRNA的研究
　　滾環(huán)擴(kuò)

5、增（RCA）是一種高效的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，也是生物傳感器構(gòu)建過(guò)程中常用的信號(hào)放大策略之一。通常，為提高傳感器的靈敏度，在引入RCA之前往往會(huì)級(jí)聯(lián)一個(gè)目標(biāo)物循環(huán)的信號(hào)放大策略，然而，由于這種級(jí)聯(lián)的信號(hào)放大策略是分步進(jìn)行目標(biāo)物循環(huán)與 RCA，因此操作步驟繁瑣且RCA效率相對(duì)較低。本工作設(shè)計(jì)了新穎的目標(biāo)物循環(huán)同步RCA的信號(hào)放大策略并基于此構(gòu)建了超靈敏和簡(jiǎn)單的ECL生物傳感器用于microRNA的檢測(cè)。值得一提的是，我們巧妙地設(shè)計(jì)了由富含鳥嘌

6、呤（G-rich）的區(qū)域和與引物雜交的區(qū)域組成的環(huán)形模板，在目標(biāo)物miR-21存在的情況下，環(huán)形模板的結(jié)合區(qū)域與引物、miR-21雜交，形成三元“P”結(jié)構(gòu)，然后，從引物的3'端引發(fā)RCA。隨著RCA的進(jìn)行，目標(biāo)物miR-21被釋放并參與下一個(gè)RCA的引發(fā)。由于環(huán)形模板富含G堿基序列，因此目標(biāo)物循環(huán)同步RCA的產(chǎn)物具有串聯(lián)周期性富含胞嘧啶（C-rich）序列，以此作為配體進(jìn)一步原位電化學(xué)生成銀納米簇（Ag NCs）作為ECL信號(hào)探針。目標(biāo)

7、物miR-21的濃度與Ag NCs的ECL強(qiáng)度呈正相關(guān)。該ECL分析法在miR-21濃度為100 amol·L-1至100 pmol·L-1的范圍展現(xiàn)出優(yōu)異的線性響應(yīng)和低至22 amol·L-1的檢測(cè)限。
　　3.基于適體識(shí)別觸發(fā)發(fā)夾組裝無(wú)酶信號(hào)放大策略構(gòu)建ECL適體傳感器檢測(cè)黏蛋白的研究
　　核酸適配體識(shí)別目標(biāo)物時(shí)往往伴隨著核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換，這種特性使核酸信號(hào)放大策略在適體傳感器中同樣能夠發(fā)揮巨大的作用。酶輔助的目標(biāo)物循

8、環(huán)信號(hào)放大策略利用酶的聚合或剪切活性使目標(biāo)物多次循環(huán)觸發(fā)適體識(shí)別過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的目的。然而引入生物酶增加了傳感器的經(jīng)濟(jì)成本以及為滿足酶活性的苛刻檢測(cè)條件，這限制了酶在生物傳感器中的應(yīng)用范圍。本工作基于適體識(shí)別引起適體DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換及DNA自組裝技術(shù)觸發(fā)的目標(biāo)物循環(huán)的信號(hào)放大策略，結(jié)合多孔自增強(qiáng)Ru(II)聚合物空心納米微球作為ECL信號(hào)標(biāo)簽，構(gòu)建了ECL適體傳感器檢測(cè)黏蛋白MUC1。首先，設(shè)計(jì)了含MUC1適體序列的發(fā)夾型DN