基于納米金信號轉(zhuǎn)換和信號放大的新型生物傳感技術(shù)研究.pdf

1、納米金具有獨(dú)特的光學(xué)效應(yīng),其表面等離子體共振吸收峰的位置與顆粒的大小、形貌及聚集狀態(tài)密切相關(guān),摩爾吸光系數(shù)高。此外,納米金具有優(yōu)良的晶核催化功能,能夠催化金屬離子還原并沉積于納米金表面。通過生物識別過程使納米金的聚集狀態(tài)發(fā)生一定程度的改變,然后監(jiān)測其表面等離子體共振吸收的變化,或者利用納米金催化性能使金屬離子還原為金屬原子,根據(jù)金屬離子(或金屬原子)數(shù)量的改變從而使體系的物理化學(xué)參數(shù)發(fā)生相應(yīng)變化,最終實(shí)現(xiàn)生物識別過程的信號轉(zhuǎn)換。

2、　　 納米金比表面積大,表面自由能高,可在顆粒表面固定大量的生物識別分子或信號分子。此外,納米金具有良好的導(dǎo)電性和宏觀隧道效應(yīng),能夠促進(jìn)電子快速傳遞,從而實(shí)現(xiàn)信號放大。
　　 納米金作為生物標(biāo)記物或者固定生物分子的優(yōu)良載體在臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域中應(yīng)用非常廣泛。本論文以腺苷、人IgE、甲胎蛋白、赭曲霉素A、汞離子為檢測對象,發(fā)展了一系列基于納米金信號轉(zhuǎn)換(第二、三、四章)以及信號放大(第五、六、七章)的新型生物傳感

3、技術(shù)。具體內(nèi)容包括：
　　 (1)基于不同構(gòu)象的核酸適體在納米金表面的吸附性質(zhì)不同,從而對納米金穩(wěn)定性的保護(hù)程度有所區(qū)別。我們以腺苷為分析模型,發(fā)展了一種簡單、快速、靈敏的基于非標(biāo)記納米金變色的比色或紫外可見吸收分光光度法[第2章]。當(dāng)體系中不存在目標(biāo)分子時,腺苷的核酸適體結(jié)構(gòu)柔軟,能夠纏繞在金納米顆粒表面,由于核酸鏈帶負(fù)電荷,納米金表面的電子云密度高,靜電斥力增強(qiáng),加入較高濃度的鹽后膠體溶液仍然保持良好分散。當(dāng)體系中存在腺苷時

4、,它與核酸適體結(jié)合誘導(dǎo)適體構(gòu)象發(fā)生變化,剛性增強(qiáng),不易吸附于納米金顆粒表面,因此在高鹽條件下出現(xiàn)一定程度的團(tuán)聚,表面等離子體共振吸收光譜發(fā)生改變,據(jù)此可用于定量檢測腺苷,線性范圍為100 nM-10μM,檢測限為51.5 nM。該方法由于在均相中操作,準(zhǔn)確度高,并且可實(shí)現(xiàn)高通量分析,也可用于其它物質(zhì)如金屬離子、蛋白質(zhì)、核酸或多肽的分析。
　　 (2)納米金是一種重要的光學(xué)材料,具有很高的消光系數(shù),其顏色變化與顆粒間的距離密切相關(guān)

5、。納米金團(tuán)聚通常分為夾心式的交聯(lián)團(tuán)聚和非交聯(lián)團(tuán)聚兩種方式。在第3章中,我們提出一種新的納米金團(tuán)聚機(jī)理,即發(fā)夾型核酸適體末端匹配修飾納米金后誘導(dǎo)納米金組裝,從而降低膠體穩(wěn)定性,加入較高濃度的鹽引起團(tuán)聚。當(dāng)溶液中存在目標(biāo)分子IgE時,適體穩(wěn)定的發(fā)夾構(gòu)型顯著抑制納米金組裝。鑒于此,我們開發(fā)了一種以IgE為分析模型的基于納米金穩(wěn)定性增強(qiáng)的均相比色分析方法。與目標(biāo)IgE結(jié)合后,核酸適體構(gòu)象發(fā)生變化,空間位阻增大,修飾到納米金表面使顆粒穩(wěn)定,呈分散

6、狀態(tài),據(jù)此可用于IgE的分析測定,線性范圍為9.45×10-13-1.89×10-8 M。與現(xiàn)有IgE檢測方法相比較,該方法靈敏度高,所需儀器設(shè)備簡便,可通過目視觀察顏色變化或紫外可見分光光度計監(jiān)測吸光度的變化。這種發(fā)夾型核酸適體衍生納米金的組裝行為在生物傳感技術(shù)中的成功應(yīng)用有助于加深理解核酸構(gòu)象變換對納米金性能的影響,同時也為設(shè)計新穎的信號探針以及開發(fā)優(yōu)良性能的比色檢測技術(shù)提供新思路。
　　 (3)開發(fā)了一種以腺苷為模型分析物

7、的靈敏、特異的新型熒光分析方法[第4章]。該方法應(yīng)用兩種納米材料標(biāo)記的核酸探針-核酸適體修飾的磁性納米顆粒和核酸探針混合修飾的金納米顆粒。利用腺苷誘導(dǎo)核酸適體的構(gòu)型轉(zhuǎn)換導(dǎo)致與其雜交的金標(biāo)核酸探針被置換,置換下來的納米金標(biāo)記物進(jìn)而催化抗壞血酸將銅離子還原為金屬銅并沉積在金納米顆粒上,使銅離子對鈣黃綠素的熒光淬滅得到抑制。由于極少量的納米金可催化大量的銅離子還原沉積,銅離子濃度急劇降低,從而靈敏改變鈣黃綠素的熒光信號。實(shí)驗結(jié)果表明,用這種方

8、法檢測腺苷得到的動力學(xué)響應(yīng)濃度范圍為100 pM到10 nM,檢測限為80 pM。此外,核酸適體的高度特異識別性能保證了該方法具有較好的選擇性。整個實(shí)驗過程都在均相中進(jìn)行,適合大批量的分析檢測。
　　 (4)構(gòu)建了一種基于納米金標(biāo)記及酶催化增強(qiáng)的電化學(xué)免疫傳感器對甲胎蛋白(AFP)進(jìn)行靈敏檢測[第5章]。金電極表面共價連接捕獲抗體選擇性地識別目標(biāo)物AFP,納米金標(biāo)記的兔抗對目標(biāo)物進(jìn)行夾心反應(yīng),偶聯(lián)堿性磷酸酯酶的羊抗兔IgG特異結(jié)

9、合兔抗形成樹枝狀酶復(fù)合物,電極表面酶分子的增加增強(qiáng)了電化學(xué)響應(yīng)信號,從而提高了傳感器的靈敏度。該方法對目標(biāo)物AFP的線性檢測范圍為1.0 ng/mL-500 ng/mL,檢測下限為0.8 ng/mL,可用于實(shí)際血清樣品中甲胎蛋白的臨床分析檢測。
　　 (5)開發(fā)了一種新型的基于間接競爭模式的電化學(xué)免疫傳感器用于農(nóng)產(chǎn)品中常見的有毒污染物一赭曲霉素A(OTA)的檢測[第6章]。該傳感器具備簡便、靈敏、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。首先在金電極表面

10、自組裝1,6-己二硫醇單分子膜,然后通過Au-S作用組裝一層金納米顆粒構(gòu)建傳感界面,從而提高赭曲霉素A-卵清蛋白(OTA-OVA)偶聯(lián)物在電極表面的負(fù)荷量,并增強(qiáng)電化學(xué)信號。當(dāng)樣品中存在游離的OTA時,它與固定于電極表面的OTA-OVA偶聯(lián)物分子競爭結(jié)合溶液中有限的小鼠抗OTA單克隆抗體,堿性磷酸酯酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG二抗選擇性地與電極表面的OTA單抗反應(yīng),據(jù)此,結(jié)合到電極表面上的酶分子數(shù)量能夠反映樣品中OTA的濃度。堿性磷酸酯酶催化

11、底物1-萘酚磷酸酯(1-NP)水解生成1-萘酚,1-萘酚具有電活性,在電極表面氧化產(chǎn)生電信號。當(dāng)OTA濃度在10 pg/mL-100ng/mL范圍內(nèi)時,氧化峰電流的大小與OTA濃度成反比,檢測下限達(dá)8.2 pg/mL。此外,在測定玉米樣品中OTA的回收率過程中,樣品的基體效應(yīng)幾乎可以忽略不計,得到回收率在85％-105.3％之間,說明該方法可望用于檢測實(shí)際樣品中OTA的含量。
　　 (6)發(fā)展了一種新型電化學(xué)生物傳感器用于檢測水

12、相中的汞離子[第7章]。首先通過己二硫醇將納米金組裝于金電極表面,納米金的存在可以增加作為捕獲探針的核酸鏈的固定量,并改善電子傳遞速率。另一條富含T堿基的核酸鏈通過與捕獲探針雜交連接到電極表面。當(dāng)存在目標(biāo)汞離子時,T-Hg(Ⅱ)-T配位作用使富T核酸鏈構(gòu)象發(fā)生變化,致使電極表面的雙鏈復(fù)合物不穩(wěn)定,富T核酸鏈從電極表面解離下來。因此,電極表面剩余的核酸鏈吸附的電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)相應(yīng)減少,響應(yīng)信號降低,降低的程度與汞離子濃度密切相關(guān)。其定量