基于納米材料和信號(hào)放大技術(shù)的新型傳感方法研究.pdf

1、近年來，生物傳感技術(shù)憑借檢測時(shí)間短、成本低、靈敏度高，選擇性好等特點(diǎn)被廣泛用于推進(jìn)化學(xué)化工和醫(yī)學(xué)臨床檢測等領(lǐng)域的發(fā)展。另外，納米材料的快速發(fā)展和信號(hào)放大技術(shù)的改進(jìn)也為構(gòu)建新型生物傳感方法提供了新的平臺(tái)和思路。在本論文中，我們提出了幾種用于檢測可卡因和與致病基因相關(guān)的核酸序列的生物傳感方法。通過結(jié)合納米材料和信號(hào)放大技術(shù)，檢測方法的信背比和靈敏度得到提高，檢測下限得到降低，具體工作內(nèi)容如下所示:
　　在第2章中，我們基于聚合酶輔助的

2、等溫循環(huán)鏈置換反應(yīng)(IRSDA)和氧化石墨烯(GO)的選擇性吸附作用，構(gòu)建了一個(gè)無標(biāo)記的熒光適配體生物傳感方法用于可卡因的檢測。由于可卡因?qū)θ梭w的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有不可恢復(fù)的損傷作用，且在全球范圍內(nèi)有被濫用的潛在可能性，因此，發(fā)展高靈敏度、高選擇性的可卡因檢測方法對醫(yī)學(xué)臨床和海關(guān)檢測等領(lǐng)域具有重大的意義。實(shí)驗(yàn)所用的發(fā)夾探針(HP)包含了可卡因的的適配體序列，且與引物鏈部分互補(bǔ)。當(dāng)可卡因與HP探針的適配體序列結(jié)合后，打開的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得引物鏈

3、與發(fā)夾探針的5'末端能夠發(fā)生互補(bǔ)雜交。在聚合酶和dNTPs輔助下，鏈增長反應(yīng)被引發(fā)，生成雙鏈DNA并將可卡因置換下來。當(dāng)溶液中不存在可卡因時(shí)，HP探針保持穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而不能與引物鏈互補(bǔ)，抑制鏈增長反應(yīng)。此外，該實(shí)驗(yàn)還結(jié)合了熒光染料SYBRGreenⅠ的雙鏈嵌入作用和GO優(yōu)先吸附單鏈DNA的性能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)熒光檢測信號(hào)的放大。檢測到的熒光信號(hào)與可卡因濃度呈正相關(guān)關(guān)系，線性范圍為0.2μM到100μM，檢測下限為190nM。該檢測方法不

4、僅操作簡便，響應(yīng)快，且靈敏度高、選擇性優(yōu)越，在復(fù)雜實(shí)際體系中也具有良好的分析表現(xiàn)。
　　在第3章中，我們設(shè)計(jì)了一個(gè)多重放大的電化學(xué)傳感方法用于實(shí)現(xiàn)核酸的超靈敏檢測，并選用致病基因序列p53基因作為目標(biāo)分析物。實(shí)驗(yàn)所用的捕獲探針(CP)被設(shè)計(jì)成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且莖部序列包含限制性內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)。CP探針通過巰基-金鍵共價(jià)作用固定在電極表面，當(dāng)目標(biāo)DNA不存在時(shí)，CP探針保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)，暴露出酶切位點(diǎn)，EcoRI酶作用后，CP探針

5、的目標(biāo)結(jié)合區(qū)域和生物素標(biāo)記序列均被剝離電極表面，抑制了背景電流信號(hào)。相反，當(dāng)CP探針與目標(biāo)DNA雜交后，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，酶切位點(diǎn)被破壞，標(biāo)記在捕獲探針上的生物素標(biāo)記遠(yuǎn)離電極表面。通過生物素和鏈霉親和素的特異性結(jié)合作用，表面修飾大量二茂鐵信號(hào)探針(Fc-SPs)的納米金顆粒被捕獲到電極表面，電化學(xué)信號(hào)得到放大。此外，DNA雙鏈雜交拖拽策略通過信號(hào)探針與EcoRI酶作用后的捕獲探針殘留鏈互補(bǔ)雜交，將Fc信標(biāo)拉近到電極表面，縮短電子傳遞距離，

6、進(jìn)一步放大電化學(xué)信號(hào)。基于以上放大作用，該檢測方法不僅獲得較寬的線性區(qū)間，且實(shí)現(xiàn)了核酸超靈敏檢測。
　　實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的高靈敏、高選擇性檢測對許多疾病的早期醫(yī)療診斷和治療具有重大的意義，尤其是癌癥診斷。在第4章中，我們開發(fā)一個(gè)電化學(xué)單核苷酸多態(tài)性基因分型傳感器用于致癌基因序列的分析檢測。為提高檢測方法的靈敏性，我們利用納米金的富集作用和表面雜交策略對電化學(xué)檢測信號(hào)進(jìn)行了有效的放大。修飾在納米金顆粒上的大量二茂鐵電活性分子通過信