肽核酸和“RecA蛋白—互補單鏈DNA探針”生物信號放大系統(tǒng)用于壓電基因傳感器的實驗研究.pdf

1、目的：以肽核酸探針及“RecA蛋白-互補單鏈DNA探針”生物信號放大系統(tǒng)提高石英諧振式基因傳感器陣列檢測系統(tǒng)的靈敏度，并探索對臨床標(biāo)本進行直接檢測的可行性。 方法：1.利用精細微加工法制作單個石英諧振式傳感器，并在其兩面光刻出金膜電極，比較了不同電極厚度及直徑對基因雜交檢測的影響。在此基礎(chǔ)上先后構(gòu)建了拔插式2×5型傳感器陣列。并自行開發(fā)研制自激式振蕩電路、PESAV2.0版頻率記錄分析軟件，將它們與計算機聯(lián)用以構(gòu)建石英諧振式基因

2、傳感器陣列檢測系統(tǒng)。 2.探討用PNA作為探針與普通的DNA探針相比對壓電傳感器基因雜交的優(yōu)越性。用生物素-親和素法分別將PNA,DNA兩種探針固定在基因傳感器的金膜表面，分別與完全匹配、一個堿基錯配、兩個堿基錯配的互補靶序列進行雜交，觀察兩種不同的探針與靶序列反應(yīng)所引起的頻率變化及所用的時間。 3.在傳感器陣列表面固定上HBV的bis-PNA探針，利用“RecA蛋白-互補單鏈DNA探針”與固定的肽核酸(bis-PNA)

3、探針相結(jié)合，摸索最適的液相反應(yīng)條件，以提高壓電基因傳感器表面的質(zhì)量負載，從而提高檢測的靈敏度。 4.實驗后期還探索了利用bis-PNA探針對36例臨床大三陽標(biāo)本和14例陰性血清中抽提的基因組DNA直接進行檢測的可行性，并比較了加入“RecA蛋白-互補單鏈DNA探針”較未加此反應(yīng)體系時，所引起的質(zhì)量-頻率效應(yīng)明顯。 結(jié)果：1.選擇了更有利于傳感器在液相中穩(wěn)定的AT切型石英晶體作為傳感器基片，金膜電極厚度在50nm-100n

4、m的范圍內(nèi)最適合于用作基因雜交的檢測，電極直徑4.0mm時插損較小，對質(zhì)量負載承受能力強。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的拔插式傳感器陣列具有方便、快速、經(jīng)濟等優(yōu)點。 2.自行研制的自激式振蕩電路有非常強的振蕩能力，在液相中起振非常容易，其頻率穩(wěn)定度也可達實用要求，同時拔插式傳感器可有效提高傳感器在液相中頻率穩(wěn)定的程度，氣、液相頻率均可達±1Hz，進一步優(yōu)化了實驗條件。 3.自行開發(fā)的PESAV2.0版頻率記錄分析軟件具有自行設(shè)置各初始

5、參數(shù)，實時記錄頻率變化、自動繪制頻率變化趨勢圖及分析結(jié)果等多項功能，采集、分析后的數(shù)據(jù)自動輸入到計算機。 4.相對于DNA探針，PNA探針識別堿基錯配的能力明顯提高，且雜交時間更短。PNA探針與靶序列DNA結(jié)合有高度的特異性，選用PNA作探針，可提高壓電基因傳感器檢測的特異性。 5.1觀察當(dāng)RecA蛋白濃度為0.5、0.85、1.5、3、4.5、6mg/ml時的反效果。結(jié)果表明，當(dāng)濃度為0.5～3mg/ml時，所引起的頻

6、率下降值依次升高，隨后又出現(xiàn)了降低，當(dāng)濃度為3mg/ml時，反應(yīng)效果最顯著。 5.2當(dāng)RecA蛋白濃度為3mg/ml時，不同濃度的ATPγS與其結(jié)合所引起的頻率下降值不同，ATPγS濃度從5μM變化至12.5μM，所引起的頻率下降依次升高，當(dāng)濃度為12.5μM，頻率下降值最大，隨后隨著濃度的升高，頻率出現(xiàn)了下降的趨勢。 6.加入“RecA蛋白-互補單鏈DNA探針”后，質(zhì)量-頻率效應(yīng)明顯，提高了反應(yīng)的靈敏度。 結(jié)論

7、：1.AT切型、基頻10MHz的石英晶體，金膜電極直徑4.0mm，厚度在50nm-100nm的范圍內(nèi)最適合用于壓電石英晶體基因傳感器。 2.自激式振蕩電路對石英諧振式基因傳感器陣列的液相振蕩進行了特別的優(yōu)化，使傳感器陣列能夠在液相中更穩(wěn)定地工作。 3.“PESAV2.0”應(yīng)用軟件是一類可實時記錄與分析石英晶體諧振頻率的新型實用性軟件。 4.新型可調(diào)拔插式傳感器檢測池可有效地提高傳感器在液相中頻率穩(wěn)定程度。

8、 5.與普通的DNA探針相比，PNA與核酸序列的結(jié)合有著極高的特異性，PNA能夠區(qū)分正確配對及錯配的序列，PNA對互補DNA的錯配容忍程度也比相應(yīng)的DNA/DNA更低，由于PNA對堿基錯配的識別能力強，用PNA作探針可大大提高反應(yīng)的特異性。 6.以設(shè)計的bis-PNA探針實現(xiàn)了對臨床標(biāo)本中HBV基因組DNA的直接檢測，而且標(biāo)本DNA的濃度范圍正好在傳感器檢測的線性范圍之內(nèi)。因此，石英諧振式傳感器陣列檢測系統(tǒng)的成功構(gòu)建為定量檢測臨