豬Sn基因鋅指核酸酶和TALEN的篩選與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是危害全球生豬養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病之一。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)具有毒力差異大、變異快和誘導(dǎo)中和抗體水平低等特點(diǎn)，疫苗接種難以獲得堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)。PRRSV主要感染豬巨噬細(xì)胞，主要由唾液酸粘附素(Sialoadhesin,S

2、n)和CD163兩個(gè)受體介導(dǎo)。與病毒蛋白相比，靶細(xì)胞上的病毒受體具有高度保守性，其基因修飾有可能阻斷不同毒株的感染，已成為抗病毒感染新的研究方向。鋅指核酸酶(zincfingernuclease，ZFN)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種定點(diǎn)基因修飾技術(shù)，而轉(zhuǎn)錄激活蛋白樣效應(yīng)分子核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）則是更新的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)。
　　 為了獲得針對(duì)豬Sn基

3、因的ZFN和TALEN用于體內(nèi)轉(zhuǎn)基因研究，本研究用兩種策略分別設(shè)計(jì)了5對(duì)針對(duì)豬Sn基因的ZFN和1對(duì)針對(duì)豬Sn基因的TALEN，分別用體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，以表達(dá)產(chǎn)物和含目標(biāo)序列的質(zhì)粒DNA進(jìn)行體外消化試驗(yàn)，旨在篩選具有特異裂解活性的ZFN或TALEN。經(jīng)靶質(zhì)粒體外切割試驗(yàn)證明，5對(duì)ZFN能與靶質(zhì)粒結(jié)合，并能將超螺旋質(zhì)粒部分線性化，但切割活性較低。設(shè)計(jì)和合成的1對(duì)TALEN，用體外轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)物進(jìn)行的體外切割試驗(yàn)