基于DNA納米技術(shù)和核酸酶的核酸化學(xué)發(fā)光傳感分析.pdf

1、隨著循環(huán)腫瘤DNA、循環(huán)microRNA（miRNA）和融合基因等在臨床疾病發(fā)生和診療中作用的逐步揭示，無細(xì)胞核酸分析在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診療中變得日趨重要?；诖耍菊撐臄M將整合臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)和生物分析化學(xué)學(xué)科交叉的最新研究成果，以DNA納米自組裝和功能核酸酶為納米級工具，結(jié)合臨床檢驗(yàn)診斷的需求，構(gòu)建一系列簡單、快速、等溫、特異、靈敏、免標(biāo)記的核酸化學(xué)發(fā)光傳感分析新策略。本研究主要包括以下三個部分：
　　1.基于核酸酶級聯(lián)指數(shù)擴(kuò)增

2、的化學(xué)發(fā)光成像用于miRNA傳感分析本研究基于功能核酸酶技術(shù)和級聯(lián)指數(shù)擴(kuò)增（exponential amplification reaction,EXPAR）分子機(jī)器，構(gòu)建高靈敏、高特異且可視化的化學(xué)發(fā)光生物傳感器，為循環(huán)miRNA提供全新檢測新策略。研究中發(fā)卡開關(guān)能夠特異識別靶miRNA并形成雜交雙鏈，從而啟動擴(kuò)增機(jī)器I，產(chǎn)生引物鏈。引物鏈與模板II探針互補(bǔ)雜交形成雙鏈進(jìn)級聯(lián)激活指數(shù)擴(kuò)增機(jī)器II，產(chǎn)生大量G四鏈體辣根過氧化物模擬酶，催

3、化發(fā)光底物發(fā)光，實(shí)現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)換輸出。發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA分子探針的設(shè)計(jì)提高檢測的特異性，級聯(lián)型的指數(shù)擴(kuò)增提高檢測的靈敏度，功能核酸酶免標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和可視化的miRNA生物傳感分析。本章所構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光傳感方法檢測miRNA的線性范圍為10fM到100pM，最低檢測限為2.91fM，且具有單堿基錯配分辨能力。同時，該傳感方法具有等溫、均相、免標(biāo)記和可視化的優(yōu)點(diǎn)，有望為循環(huán)miRNA分析和臨床疾病診斷提供有力的檢測工具。
　　2.基

4、于雙T型DNA納米開關(guān)和核酸酶的化學(xué)發(fā)光成像用于BCR/ABL融合基因傳感分析本研究基于DNA納米技術(shù)和級聯(lián)型DNA擴(kuò)增機(jī)器構(gòu)建BCR/ABL融合基因化學(xué)發(fā)光型生物傳感器，為融合基因檢測提供超靈敏、高特異的化學(xué)發(fā)光成像傳感新策略。利用NUPACK軟件設(shè)計(jì)功能化分子探針，其能夠邏輯性識在BCR/ABL融合基因并自組裝形成Bis-3WJ納米結(jié)構(gòu)（Bis-three way junction nanostructure，Bis-3WJ）。該結(jié)

5、構(gòu)激活級聯(lián)擴(kuò)增機(jī)器，產(chǎn)生大量G四鏈體辣根過氧化物模擬酶亞單元。該亞單元能夠自組裝為完整模擬酶，級聯(lián)催化化學(xué)發(fā)光底物實(shí)現(xiàn)光信號轉(zhuǎn)換輸出和邏輯門操作。本章所構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光成像檢測BCR/ABL融合基因的最低檢測限23fM，線性范圍達(dá)7個數(shù)量級，且具有邏輯識別能力和單堿基錯配分辨能力。該方法在復(fù)雜基質(zhì)中顯示好的回收率，具有等溫、均相、免標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，為慢性粒細(xì)胞白血病診斷提供全新的化學(xué)發(fā)光成像策略。
　　3.基于發(fā)卡開關(guān)和原位非線性雜交鏈

6、反應(yīng)的電致化學(xué)發(fā)光用于BCR/ABL融合基因傳感分析本研究基于發(fā)卡探針和原位分支化雜交鏈反應(yīng)（hybridization chain reaction,HCR）構(gòu)建BCR/ABL融合基因的電化學(xué)發(fā)光型生物傳感器，為慢性粒細(xì)胞白血病診斷提供操作簡便、超靈敏、高特異的傳感新策略。首先，將捕獲探針固定在金電極。隨后，將分支化雜交鏈反應(yīng)系統(tǒng)溶液滴加在電極表面，在發(fā)卡開關(guān)上的觸發(fā)鏈DNA觸發(fā)兩種底物鏈和兩種輔助鏈的級聯(lián)自組裝形成分支狀DNA納米結(jié)

7、構(gòu)。在目標(biāo)分子存在的情況下，其打開發(fā)卡開關(guān)并將分支狀DNA納米結(jié)構(gòu)連接在電極表面。這種原位HCR反應(yīng)形成的DNA納米結(jié)構(gòu)能夠通過其DNA雙鏈凹槽與電致發(fā)光指示劑(Ru(phen)32+)間的相互作用將隨后加入的指示劑引入到電極表面，從而實(shí)現(xiàn)信號的指數(shù)形式的輸出放大。發(fā)卡探針和原位非線性雜交鏈反應(yīng)的引入到電致發(fā)光傳感器設(shè)計(jì)增強(qiáng)了傳感器的特異性和靈敏度。本章所構(gòu)建的ECL方法檢測BCR/ABL融合基因的最低檢測限為5.49fM，線性范圍為1