TALEN技術(shù)構(gòu)建斑馬魚先天性心臟病gata4基因敲除模型的研究.pdf

1、目的: 先天性心臟?。–HD）是人類一種非常普遍和具有破壞性的出生缺陷性疾病，其發(fā)生與gata4基因突變有關(guān)。gata4參與調(diào)控心肌細(xì)胞中某些特定基因的表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞的形成、心臟前體細(xì)胞的遷移和分化、心瓣膜及間隔發(fā)育等具有重要作用?；蚯贸夹g(shù)構(gòu)建gata4基因敲除的動(dòng)物模型有助于人類先天性心臟病致病機(jī)制和治療的進(jìn)一步研究。類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)介導(dǎo)的靶向修飾技術(shù)是目前廣泛使用的成熟的基因敲除技術(shù)，它主要含有兩個(gè)重要

2、的結(jié)構(gòu)域:特異性識(shí)別核酸的靶點(diǎn)識(shí)別域和切斷DNA序列的核酸酶功能結(jié)構(gòu)域。人工構(gòu)建針對(duì)gata4基因第一外顯子的重組核酸酶TALEN，在體內(nèi)對(duì)特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，利用細(xì)胞自身DNA損傷后的NHJE引入基因突變、敲除或敲入，實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)修飾的目的，并建立斑馬魚先天性心臟病gata4基因敲除的動(dòng)物模型。
　　方法: 采用生物信息學(xué)方法分析斑馬魚gata4基因的編碼序列，利用靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件選擇合適的打靶位點(diǎn)，針對(duì)第一外顯子設(shè)計(jì)了一

3、對(duì)靶點(diǎn)。使用單元組裝法克隆構(gòu)建特異性TALE靶點(diǎn)結(jié)合域，組裝完成后通過菌液PCR、測(cè)序驗(yàn)證TALE是否組裝正確。將TALE靶點(diǎn)結(jié)合域克隆到真核表達(dá)載體pCS2-PEAS和pCS2-PERR中，得到gata4基因的左、右半位點(diǎn)的重組核酸酶質(zhì)粒，通過菌液PCR、酶切、測(cè)序驗(yàn)證打靶載體是否正確。線性化打靶載體DNA，使用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄成mRNAs，通過顯微注射的方式注入斑馬魚單細(xì)胞期受精卵中，酶切法檢測(cè)TALEN的體內(nèi)活性。待注

4、射的斑馬魚性成熟后，通過逐條剪尾、酶切檢測(cè)發(fā)生基因突變的斑馬魚，TA克隆測(cè)序確認(rèn)突變體的基因型，篩選出gata4基因敲除的斑馬魚。
　　結(jié)果: 菌液PCR、酶切、測(cè)序結(jié)果均證實(shí)成功地構(gòu)建出了正確的針對(duì)gata4第一外顯子左、右半位點(diǎn)的重組核酸酶，斑馬魚胚胎體內(nèi)活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TALEN的效率為35.18％，通過逐條剪尾、PCR、酶切法檢測(cè)成功地篩選出了19條gata4基因發(fā)生突變的斑馬魚，測(cè)序結(jié)果顯示斑馬魚突變體產(chǎn)生了不同片段大小、不