stat1a基因CRISPR敲除對(duì)斑馬魚早期胚胎骨骼發(fā)育的影響研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松表現(xiàn)為較低的骨密度，是一種容易導(dǎo)致骨折的全身性骨骼疾病，嚴(yán)重影響公眾健康，與骨骼發(fā)育有密切關(guān)系。本研究室早期通過基因差異表達(dá)譜分析和基因組關(guān)聯(lián)分析等，發(fā)現(xiàn)STAT1基因與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，但不清楚STAT1基因在體調(diào)控骨骼發(fā)育而導(dǎo)致骨表型改變的作用機(jī)制，所以本研究結(jié)合分子遺傳學(xué)手段，選擇斑馬魚模型進(jìn)行在體研究，進(jìn)一步揭示骨骼發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防、診斷、治療以及藥物開發(fā)都有重要意義。斑馬魚與人類在骨骼發(fā)育過程中的

2、基因、信號(hào)通路有高度同源性，且STAT1基因進(jìn)化上較為保守，人類STAT1基因的兩個(gè)不同剪接體STAT1-alpha和STAT1-beta對(duì)應(yīng)于斑馬魚兩個(gè)不同基因stat1a和stat1b，研究發(fā)現(xiàn)stat1a在斑馬魚胚胎早期表達(dá)量特別高。而且，與其他動(dòng)物模型相比，斑馬魚個(gè)體小、幼魚通體透明，利于骨骼發(fā)育的觀察。
　　本文主要通過CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，在斑馬魚stat1a基因上設(shè)計(jì)合適的打靶位點(diǎn)，將體外合成的特異性s

3、gRNA(終濃度20ng/μL)和Cas9-mRNA（終濃度300 ng/μL）顯微共注射進(jìn)斑馬魚一細(xì)胞內(nèi)，并通過活性檢測(cè)證實(shí)了所選位點(diǎn)的有效性。對(duì)F0代斑馬魚提取基因組DNA后進(jìn)行T7E1酶切檢測(cè)以及Sanger測(cè)序，成功篩選到2條stat1a基因突變的F0代斑馬魚。在F1代受精后20天、30天和47天，隨機(jī)挑取兩個(gè)突變體的F1代斑馬魚和野生型斑馬魚各10條，測(cè)量其長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)突變體F1代斑馬魚要比野生型生長(zhǎng)速度更快。結(jié)果與小鼠stat

4、1-/-敲除研究發(fā)現(xiàn)骨密度與骨量增加一致，提示stat1可能通過抑制成骨細(xì)胞生成影響骨骼發(fā)育。目前，已經(jīng)從F2代胚胎中鑒定到stat1a突變體純合子。用Phyre軟件預(yù)測(cè)F1代突變體STAT1蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的某些保守結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)發(fā)生改變。STAT1蛋白的V638和S639處是同源二聚體界面，對(duì)應(yīng)于F1代突變體的這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)，V630和S631卻不再是同源二聚體接觸面?？赡苁怯捎趕tat1a基因突變影響STAT1同源二

5、聚體的結(jié)合，影響骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，從而導(dǎo)致斑馬魚生長(zhǎng)更快。
　　為進(jìn)一步分析stat1a基因敲除后的變化，利用不同濃度STAT1抑制劑磷酸氟達(dá)拉濱(Fludarabine)處理斑馬魚胚胎10天，發(fā)現(xiàn)隨濃度增加死亡率也隨之增加。低于5μg/mL濃度組的死亡率低于10％，10μg/mL、20μg/mL以及40μg/mL濃度組死亡率達(dá)到30％-40％，而50μg/mL濃度組從處理第5天開始，死亡率接近70％。從處理第3天開始，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚