利用啟動子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因.pdf

1、1954年,第一例人類同種腎移植手術(shù)在美國完成,開啟了人類醫(yī)學(xué)的新時代,這項研究的開創(chuàng)者約瑟夫·默里也獲得了1990年諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進步,器官移植的存活率大幅提高,接受手術(shù)的人數(shù)也大幅增長。人類同種異體器官移植已經(jīng)拯救了成千上萬器官衰竭患者的生命,被譽為“21世紀(jì)醫(yī)學(xué)之巔”。
　　 然而,隨著器官移植需求數(shù)量的增長,器官短缺的問題也日益凸顯,已經(jīng)成為制約臨床器官移植發(fā)展的主要瓶頸。異種移植可以緩解器官不

2、足的現(xiàn)狀,豬由于在解剖學(xué)、生理學(xué)等方面與人類的相似性,成為科學(xué)界公認(rèn)的異種器官移植最合適的異種器官來源。然而,豬器官應(yīng)用于臨床實驗面臨著諸多難題,其中最為關(guān)鍵的障礙是超急性排斥反應(yīng)(Hyperacute Rejection,HAR)。HAR主要是由α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因編碼的形成的αGal表位引起,通過敲除GGTA1基因可以消除αGal表位從而克服HAR,自從20

3、03年以來,國外已有報道缺失GGTA1基因的豬器官已經(jīng)用于異種器官移植實驗并成功克服了HAR。然而,國內(nèi)這方面的研究起步較晚,尚未見有GGTA1基因敲除克隆豬出生的報道。
　　 五指山近交系小型豬是我國培育的高度近交群體。其基因高度純合,便于基因工程操作；血液生理生化指標(biāo)與人類接近,器官大小近似人類,是更為理想的異種器官移植供體。
　　 本研究構(gòu)建了以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycin phosphotransferas

4、e,neo)為篩選標(biāo)記基因的啟動子缺陷型打靶載體,neo基因上游加入Kozak序列以增加翻譯效率。打靶載體線性化后用電轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入胎兒成纖維細胞中,轉(zhuǎn)染后的細胞經(jīng)G418篩選。用PCR法檢測藥物抗性的細胞克隆點。轉(zhuǎn)染篩選共得到499個具有G418抗性的細胞克隆,經(jīng)PCR檢測,其中2個細胞克隆發(fā)生了同源重組。以其中1個GGTA1+/-細胞克隆為供體細胞進行核移植,將重構(gòu)胚移植到2頭自然發(fā)情的受體母豬中,一頭受體懷孕,分娩獲得2頭克隆豬,

5、分別編號為WZSP-K001和 WZSP-K002,經(jīng)過PCR和Southern鑒定均為GGTA1單等位基因敲除克隆豬。本研究培育GGTA1基因敲除的五指山小型豬,為異種器官移植研究提供基礎(chǔ)平臺。
　　 研究內(nèi)容主要分為以下三個部分:
　　 第一部分:啟動子缺陷型打靶載體pBS-GGTA1-SKO的構(gòu)建
　　 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的GGTA1基因序列設(shè)計引物,LAF/LAR和SAF/SAR分別擴增5684bp的同源

6、長臂,1692bp的同源短臂。以近交系五指山小型豬基因組為模版,PCR擴增得到5684bp的同源長臂(Long Arm,LA),1692bp的同源短臂(Short.Arm,SA),將LA和SA分別克隆到T載體pEASY-T1 Simple上,測序正確后得到重組載體pEASY-T1-LA,pEASY-T1-SA。
　　 打靶骨架載體pBluescriptⅡSK(+)和pEASY-T1—SA分別用KpnⅠ和BglⅡ雙酶切、凝膠電泳回

7、收載體骨架PBS和SA片段,用T4 DNA連接酶連接,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定后得到載體PBS-SA。載體PBS-SA和pIRESneo分別用SmaⅠ和XhoⅠ雙酶切、凝膠電泳回收PBS-SA和neo片段,用T4 DNA連接酶連接,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定后得到載體PBS-SA-neo。載體PBS-SA-neo和pEASY-T1-LA分別用NotⅠ和ClaⅠ雙酶切、凝膠電泳回收PBS-SA-neo和LA片段,用T4 DNA連接酶

8、連接,轉(zhuǎn)化后篩選重組子、提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定后獲得五指山小型豬GGTA1基因敲除載體pBS-GGTA1-SKO。
　　 打靶載體pBS-GGTA1-SKO全長約12Kb,包括5684bp同源長臂LA和1692bp同源短臂SA,pBS-GGTA1-SKO質(zhì)粒經(jīng)不同的限制性內(nèi)切酶酶切后獲得相應(yīng)的正確的大小不等的片段。
　　 第二部分:五指山小型豬胎兒成纖維細胞的轉(zhuǎn)染篩選與鑒定
　　 利用限制性內(nèi)切酶ClaⅠ酶切質(zhì)粒p

9、BS-GGTA1-SKO,使之線性化。細胞采用Amaxa NucleofectorⅡ核轉(zhuǎn)染儀及配套轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將細胞接種至六孔板中,待細胞長至80～90％匯合時,利用電轉(zhuǎn)染法將線性化的打靶載體pBS-GGTA1-SKO按照NucleofectorⅡ核轉(zhuǎn)染儀程序T016轉(zhuǎn)染至五指山豬胎兒成纖維細胞,24 h后加入G418(250μg/mL)篩選10～15 d,然后將具有抗性的細胞克隆傳至24孔板中進行擴增,每孔細胞按1:2傳至

10、另一24孔板中,取其中1孔細胞用于PCR鑒定,另1孔細胞凍存?zhèn)溆谩Ｌ崛】剐约毎寺↑cDNA進行PCR鑒定,對陽性細胞克隆同源重組區(qū)進行測序驗證。
　　 打靶載體共轉(zhuǎn)染細胞1.5×107個,經(jīng)過篩選獲得G418抗性細胞克隆499個,為了驗證細胞克隆點是否發(fā)生了同源重組,根據(jù)同源重組的位點,利用2對引物分別對這些克隆點進行了兩輪PCR檢測,PCR鑒定所用引物為P1F/P1R和P2F/P2R,結(jié)果有2個克隆點可以擴增出了大小正確的PC

11、R產(chǎn)物,分別為1890bp和5895bp,命名為G12和G13。對這2個陽性克隆點進行DNA測序,測序結(jié)果證實細胞發(fā)生了正確的同源重組。
　　 第三部分:核移植與胚胎移植及克隆豬的鑒定
　　 以GGTA1+/-細胞為供體細胞,采用顯微操作盲吸法去核和電融合法進行核移植,克隆胚胎體外培養(yǎng)1-2天,將1-2細胞階段的重構(gòu)胚移植到2頭受體豬中,移植方法為手術(shù)法輸卵管深部移植,每頭移植200枚左右胚胎。將1-2細胞階段的重構(gòu)胚移

12、植到2頭受體母豬中,30天B超檢測,1頭受體母豬妊娠,妊娠率為50％。代孕母豬分娩共產(chǎn)仔2頭,分別編號為 WZSP-K001和WZSP-K002。
　　 提取克隆豬組織基因組DNA,以基因組DNA為模板,通過PCR方法獲得地高辛標(biāo)記探針。用 NcoⅠ酶切基因組DNA12 h以上(20μg),在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳過夜,凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上固定后進行雜交。
　　 經(jīng)過PCR和southern鑒定2頭克隆豬均為G

13、GTA1單等位基因敲除豬,PCR鑒定所用引物為P1F/P1R和P2F/P2R,均擴增出了大小正確的 PCR產(chǎn)物,分別為1890 bp和5895bp。Southern鑒定陽性克隆豬出現(xiàn)兩條雜交帶:GGTAI單基因敲除的克隆豬Southern雜交出現(xiàn)兩條帶,野生型GGTA1基因在8kb處,同源重組型的GGTAI基因出現(xiàn)在5.4kb處,兩條帶亮度比例為1:1。而未發(fā)生同源重組的GGTAI基因僅有一條8 kb雜交帶,證實這兩頭克隆豬均為GGTA