大豆抗原蛋白誘發(fā)五指山小型仔豬過(guò)敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

1、大豆蛋白大豆蛋白glycinin和?conglycinin經(jīng)口誘發(fā)五指山小型豬過(guò)敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)口誘發(fā)五指山小型豬過(guò)敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究黃瓊1徐海濱2楊杏芬1黃俊明1于州2高芃2劉珊2廣東省疾病預(yù)防控制中心毒理實(shí)驗(yàn)所，廣州510300摘要：目的摘要：目的建立適用于評(píng)價(jià)食物中潛在致敏物質(zhì)的五指山小型豬大豆球蛋白（11S）和β伴球蛋白（7S）經(jīng)口致敏模型。方法方法20頭1.5月齡五指山小型豬分別攝入含0％、4％11S、8％11S、4％7S、8

2、％7S大豆蛋白的飼料，通過(guò)胃腸道致敏(010d)和反復(fù)經(jīng)口激發(fā)(1618d31d)誘導(dǎo)致敏反應(yīng)，從皮膚試敏反應(yīng)、血清IgG、IgE和組胺水平、小腸組胺含量和肥大細(xì)胞數(shù)量、外周血淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子表達(dá)等方面進(jìn)行模型評(píng)價(jià)和可能致敏機(jī)制的探討。結(jié)果結(jié)果接受11S或7S經(jīng)口致敏的仔豬皮膚試敏試驗(yàn)呈不同程度的陽(yáng)性反應(yīng)；致敏組仔豬血清中IgG、IgE抗體和組胺含量在第19d即激發(fā)期后達(dá)到最高，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)仔豬血清中IgG、IgE抗體和組胺含量?jī)蓛?/p>

3、呈正相關(guān)；實(shí)驗(yàn)第19d4％11S和4％7S致敏組血清中IgG、IgE抗體和組胺含量均高于對(duì)照組，第32d4％11S和4％7S致敏組IgE抗體和4％11S致敏組IgG抗體和組胺含量均高于對(duì)照組；空腸組胺含量與十二指腸組胺、回腸組胺含量呈正相關(guān)，而與空腸粘膜層和粘膜下層肥大細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)；4％7S致敏組空腸組胺高于對(duì)照組，4％11S致敏組空腸粘膜下層肥大細(xì)胞數(shù)目低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)第19d4％7S致敏組血清中IFN?含量較對(duì)照組降低；實(shí)驗(yàn)終期8

4、％11S致敏組外周血CD4CD8比值較對(duì)照組升高，以上差異比較或相關(guān)性檢驗(yàn)均有顯著性意義（P0.05或0.01）。結(jié)論結(jié)論由大豆蛋白glycinin和βconglycinin誘發(fā)的五指山小型豬食物致敏模型屬I(mǎi)gE介導(dǎo)的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)類(lèi)型，可用于食物潛在致敏性的評(píng)價(jià)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：食物過(guò)敏大豆球蛋白大豆伴球蛋白五指山小型豬ExperimentalstudiesofanaphylacticreactionsinWZSminipigallyi

5、nducedbysoybeanglycinin?conglycininHUANGQiongXUHaibinYangXingfenHuangJunmingYuZhouGAOPengLiuShanInstituteofToxicologyCenterfDiseaseControlPreventionofGuangdongProvinceGuangzhou510300China基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部973計(jì)劃（No:2007CB109207）通

6、訊作者簡(jiǎn)介：徐海濱，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品毒理學(xué)，轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)，Email：hbxu1231602@vip.1廣東省疾病預(yù)防控制中心2中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所合制訂的判定樹(shù)分析法(decisiontreeapproach)[5]，該方法包括結(jié)構(gòu)分析和氨基酸序列比較；理化特性研究如消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)在食物中的含量及消費(fèi)模式等。2001年FAOWHO在該判定樹(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了發(fā)展和完善主要增加了靶

7、血清篩選試驗(yàn)和動(dòng)物模型試驗(yàn)內(nèi)容并認(rèn)為食物致敏動(dòng)物模型是評(píng)價(jià)其潛在致敏性最直接的方法再次肯定了開(kāi)展食物致敏動(dòng)物模型研究的必要性和意義[6]。研究至今，食物致敏動(dòng)物模型主要用于驗(yàn)證過(guò)敏性疾病的免疫治療物質(zhì)有效性和預(yù)測(cè)對(duì)人類(lèi)有潛在致敏性的物質(zhì)兩方面。動(dòng)物種屬涵蓋嚙齒類(lèi)動(dòng)物和非嚙齒類(lèi)動(dòng)物，前者主要是小鼠、大鼠和豚鼠，后者包括狗、豬等。目前國(guó)際上尚未建立食物致敏性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型，實(shí)際上任何單一模型不可能適用所有目的，至今也未發(fā)現(xiàn)一種可重復(fù)2～

8、3種以上常見(jiàn)食物致敏原在人體引起的過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物模型，關(guān)鍵是要根據(jù)研究目的和各種模型特點(diǎn)進(jìn)行針對(duì)性地選擇[7]。比如嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型多適用于分子和細(xì)胞水平的致敏機(jī)制研究，并具有費(fèi)用少、易獲得和易操作的優(yōu)勢(shì)。而在進(jìn)行過(guò)敏性疾病研究，如更多關(guān)注皮膚、呼吸道和胃腸道等臨床癥狀的改變則可考慮使用大動(dòng)物如豬和狗等作為模型。近年來(lái)，一些非嚙齒類(lèi)大動(dòng)物如豬和狗等，由于諸多優(yōu)勢(shì)逐漸被食物致敏研究者們關(guān)注和利用：(1)確認(rèn)的對(duì)天然過(guò)敏食物的臨床和免疫學(xué)表現(xiàn)

9、；(2)與人類(lèi)更近似的解剖學(xué)、生理學(xué)和營(yíng)養(yǎng)需要特點(diǎn)；(3)與人類(lèi)更近似的免疫病理學(xué)、機(jī)制學(xué)和治療性干預(yù)策略；(4)可反復(fù)多次胃腸道內(nèi)窺鏡觀察；(5)可獲得大量免疫器官或細(xì)胞進(jìn)行研究；(6)可減少單位體重致敏原使用濃度。當(dāng)然這些大動(dòng)物研究的一些缺點(diǎn)也是易見(jiàn)的，主要集中在種屬與品系的有限性，基因敲除品系尚不可得，免疫方法研究試劑的缺乏，大體積而小樣本以及較為昂貴的費(fèi)用等方面[8]。與其它動(dòng)物模型比較，豬在研究致敏原發(fā)病機(jī)理和免疫應(yīng)答等方面有

10、許多更重要的優(yōu)點(diǎn)。除與人類(lèi)在胃腸道生理學(xué)和黏膜免疫發(fā)育上的極相似性外，同時(shí)由于具有先天免疫反應(yīng)活性使得利用豬進(jìn)行免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)更為有效和可能。目前進(jìn)行豬的致敏模型研究只在個(gè)別實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展[910]，利用豬致敏模型篩選轉(zhuǎn)基因食品的潛在致敏性尚未見(jiàn)研究報(bào)道。大豆作為一種優(yōu)質(zhì)植物性蛋白原料，已被廣泛應(yīng)用食品和動(dòng)物飼料生產(chǎn)中，但由于其含有的多種抗?fàn)I養(yǎng)成分影響了其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和利用。大豆抗原蛋白是大豆中最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，而大豆球蛋白（glycini

11、n）和?伴球蛋白（?conglycinin）是兩種免疫原性最強(qiáng)的大豆抗原蛋白，諸多研究對(duì)兩者的免疫血特性和致敏性作了廣泛研究，現(xiàn)已明確這兩種蛋白是引起動(dòng)物大豆過(guò)敏反應(yīng)的主要物質(zhì)[11]。本研究以我國(guó)自主馴化和成功培育的實(shí)驗(yàn)用近交系五指山小型豬作為模式動(dòng)物，采用大豆抗原蛋白glycinin和?conglycinin作為陽(yáng)性致敏物，建立適用于評(píng)價(jià)食物中潛在致敏物質(zhì)致敏性的大動(dòng)物模型，旨在為我國(guó)建立轉(zhuǎn)基因食品致敏性的評(píng)價(jià)程序提供一定理論依據(jù)和

12、實(shí)驗(yàn)參考。1材料與方法材料與方法1.1大豆抗原蛋白大豆抗原蛋白純化的大豆提取物glycinin（以下簡(jiǎn)稱(chēng)11S）和?conglycinin（以下簡(jiǎn)稱(chēng)7S）蛋白由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院郭順堂教授惠贈(zèng)（專(zhuān)利號(hào)為：No200410029589.4），冷凍干燥磨粉后4℃冷藏保存，經(jīng)SDSPAGE電泳和考馬斯亮蘭染色后分析，純度分別為85％和80％。1.2動(dòng)物和飼料動(dòng)物和飼料20頭（4窩5頭）五指山小型豬仔豬由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提