松江鱸(Trachidermus fasciatus)幾種凝集素的基因克隆與功能研究.pdf

1、松江鱸(Trachidermusfasciatus Heckel)隸屬于鮋形目(Scorpaeniformes)，杜父魚(yú)科(Cottidae)，松江鱸屬(Trachidermus)。歷史上松江鱸分布較廣，是我國(guó)渤海、黃海、東海沿岸及相鄰淡水水域的習(xí)見(jiàn)魚(yú)類(lèi)。但自上世紀(jì)70年代以來(lái)，因?yàn)槿藗兊倪^(guò)度捕撈，以及棲息地和繁殖地的嚴(yán)重破壞，其種群數(shù)量急劇降低。目前，松江鱸在我國(guó)許多水域已絕跡。松江鱸已列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。為恢復(fù)其自然種群，人工養(yǎng)殖

2、勢(shì)在必行。然而養(yǎng)殖過(guò)程中多種應(yīng)激刺激的存在勢(shì)必會(huì)引起各種疾病的出現(xiàn)和蔓延。只有深入開(kāi)展松江鱸免疫機(jī)制的研究，才可以在人工養(yǎng)殖中采取有效的方法防治疾病，并且為養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高提供長(zhǎng)遠(yuǎn)的管理措施。凝集素通過(guò)介導(dǎo)蛋白質(zhì)-碳水化合物的相互作用而成為動(dòng)物先天免疫的重要組成部分，不僅參與病原體識(shí)別過(guò)程，同時(shí)也負(fù)責(zé)凝集細(xì)菌，固化細(xì)菌，激活補(bǔ)體，調(diào)理以及殺菌，甚至能夠調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程。面對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中日益增長(zhǎng)的細(xì)菌、病毒、真菌以及寄生蟲(chóng)感染，考慮

3、到各種凝集素不僅能夠快速識(shí)別以及從體內(nèi)清除病原菌，而且還能引發(fā)長(zhǎng)期有效的適應(yīng)性免疫，這激發(fā)了我們對(duì)松江鱸凝集素免疫作用的研究興趣。本研究從松江鱸體內(nèi)鑒定出三種凝集素(F型，C型，Galectin)和甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶MASP，并對(duì)它們的特性和功能進(jìn)行了較為全面而系統(tǒng)的研究，得到如下結(jié)果:
　　 1.一種含雙結(jié)構(gòu)域的半乳糖結(jié)合凝集素(Tfgal-9)參與松江鱸對(duì)細(xì)菌的免疫我們從松江鱸中克隆得到一個(gè)galectin-

4、9，命名為T(mén)fGal-9。其cDNA全長(zhǎng)1453bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)900 bp，編碼299個(gè)氨基酸。TfGal-9含有兩個(gè)串聯(lián)的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domains，CRDs)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域均包含2個(gè)保守的糖結(jié)合位點(diǎn)H-NPR和WG-EER。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析表明，半乳糖結(jié)合凝集素廣泛表達(dá)于松江鱸各組織，但在腸中表達(dá)最為豐富;其次是血、心、腦。LPS刺激后，在檢測(cè)的五

5、個(gè)組織（血液、皮膚、肝臟、胃和心）中，TfGal-9 mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)。重金屬刺激后腦TfGal-9表達(dá)顯著上調(diào)。利用體外重組表達(dá)的TfGal-9蛋白研究其功能，發(fā)現(xiàn)TfGAL-9不依賴(lài)鈣離子選擇性凝集和結(jié)合部分細(xì)菌。管碟法檢測(cè)得知TfGal-9能夠抑制金黃色葡萄球菌(S.aureus)的活性。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明TfGal-9對(duì)DPPH自由基具有清除能力。這些結(jié)果表明TfGal-9參與松江鱸對(duì)細(xì)菌的先天免疫，并具有抗氧化活性。這是

6、迄今為止首次在魚(yú)類(lèi)對(duì)galectin-9的抗菌抗氧化活性進(jìn)行研究。
　　 2.松江鱸補(bǔ)體的凝集素激活途徑:TfCol-11及MASP的基因克隆與功能研究從松江鱸中鑒定的C-型凝集素collectin-11(TfCol-11)全長(zhǎng)CDN序列開(kāi)放性閱讀框?yàn)?95 bp，編碼264個(gè)氨基酸。它包含三個(gè)不同的區(qū)域:(1)含有典型的Gly-X-Y重復(fù)序列的膠原樣區(qū)域;(2)頸區(qū);(3)C-末端的CRD結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含保守的可以結(jié)合甘露糖的Gl

7、u-Pro-Asn(EPN)基序。同時(shí)我們還克隆得到松江鱸MASP部分cDNA序列(包括96 bp的5'非編碼區(qū)共993 bp)，編碼的氨基酸包含兩個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域和一個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域(CUB-EGF-CUB)。RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)TfCol-11和MASP共表達(dá)于松江鱸肝臟，LPS刺激會(huì)引起二者在皮膚、血液、肝臟和鰓表達(dá)明顯上調(diào)，值得注意的是兩基因上調(diào)模式基本一致。利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得TfCol-11和MASP重組蛋白。Ca2+存在條件下

8、，TfCol-11可凝集兔紅血細(xì)胞及多種細(xì)菌，且不依賴(lài)于Ca2+結(jié)合多種細(xì)菌。在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TfCol-11能夠顯著降低鰻弧菌(Vibrio anguillarum)引起的鯉魚(yú)致死率。通過(guò)pull-down試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TfCol-11與MASP可以相互結(jié)合。根據(jù)這些結(jié)果推斷TfCol-11可以激活松江鱸的補(bǔ)體系統(tǒng)，參與對(duì)細(xì)菌的免疫。
　　 3.松江鱸巖藻糖糖結(jié)合凝集TfFBL的基因克隆與功能研究本研究利用EST（表達(dá)序列標(biāo)簽）和RAC

9、E(cDNA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)從松江鱸中克隆一個(gè)F-型凝集素(TfFBL)。TfFBL的cDNA開(kāi)放性閱讀框?yàn)?33 bp，可編碼310個(gè)氨基酸。TfFBL包含一個(gè)信號(hào)肽以及緊隨其后的兩個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域。每個(gè)結(jié)構(gòu)域含保守基序HX26RX5-6R。qRT-PCR分析顯示TfFBL在卵中表達(dá)量最大，其次為皮膚、脾臟、腎臟、心臟和鰓。在受到LPS刺激后其表達(dá)量在血液、肝臟和皮膚中有明顯的上調(diào)，其中在肝臟、血液，LPS刺激后2 h TfFBL表達(dá)