抗紋枯病基因的克隆及轉(zhuǎn)基因小麥的研究.pdf

1、本研究通過對植物防衛(wèi)基因TaLTP4和PvPGIP2的克隆及其轉(zhuǎn)基因小麥和組織特異性啟動子RSS1P進(jìn)行研究，初步得到了抗紋枯病等土傳真菌病害的轉(zhuǎn)基因小麥植株。其主要結(jié)論如下：
　　 （1）利用同源克隆策略和RT-PCR技術(shù)，成功克隆到了一個(gè)小麥的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白編碼基因TaLTP4，并以pAHC25為骨架載體，構(gòu)建了pA25-Ubi::TaLTP4表達(dá)載體，采用基因槍法，將pA25-Ubi::TaLTP4轉(zhuǎn)入小麥品種“揚(yáng)麥18”中

2、。對轉(zhuǎn)Ubi:：TaLTP4基因小麥T0-T2代植株進(jìn)行 PCR、Q-RT-PCR和紋枯病菌接種及其抗性鑒定技術(shù)，分子檢測結(jié)果表明，TaLTP4基因轉(zhuǎn)入了小麥品種“揚(yáng)麥18”中,并能夠遺傳，轉(zhuǎn)基因小麥中TaLTP4的表達(dá)量均高于受體對照小麥品種“揚(yáng)麥18”。對轉(zhuǎn)Ubi::TaLTP4基因小麥的紋枯病抗性鑒定，得到了抗紋枯病的轉(zhuǎn)基因小麥材料。證明TaLTP4超量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因小麥對紋枯病菌的抗性。利用離體培養(yǎng)鑒定法和PCR鑒定法，對轉(zhuǎn)

3、TaLTP4基因小麥的T2代株系進(jìn)行了紋枯病的抗病性分析，結(jié)果與活體接種方法獲得的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明了TaLTP4基因?qū)π←溂y枯病具有防御作用。
　　 （2）利用同源基因克隆策略和RT-PCR技術(shù)，成功克隆了1個(gè)菜豆的多聚半乳糖酸醛酶抑制蛋白（PvPGIP2）編碼基因，由于它和小麥的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（TaLTP4）編碼基因在功能上具有協(xié)同作用，本研究以pAHC25為骨架構(gòu)建了PvPGIP2和TaLTP4基因雙價(jià)表達(dá)載體，對該雙

4、價(jià)表達(dá)載體進(jìn)行菌落PCR篩選、限制酶消化鑒定和測序分析，結(jié)果表明構(gòu)建的PvPGIP2和TaLTP4 雙價(jià)基因表達(dá)載體是成功的，該載體包含PvPGIP2表達(dá)盒和TaLTP4表達(dá)盒，分別受玉米泛素基因(Ubiqiutin)啟動子的驅(qū)動，選用來源于Ti質(zhì)粒中胭脂堿合成酶基因的終止序列作為終止子（Tnos）。采用基因槍法轟擊小麥品種揚(yáng)麥18成熟胚愈傷組織2000枚,經(jīng)過2次Bialaphos 篩選,最終獲得揚(yáng)麥18再生植株112株，利用表達(dá)載體

5、基因的特異引物對上述成活的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測,獲得PvPGIP2基因和TaLTP4均為陽性的植株12株,轉(zhuǎn)化率為0.6 ％。
　　 （3）RSS1P是1個(gè)韌皮部組織特異表達(dá)啟動子。對轉(zhuǎn)RSS1P::TiERF1基因小麥T1代植株進(jìn)行PCR、PCR-Southern、半定量RT-PCR和熒光定量PCR分析，證實(shí)轉(zhuǎn)入的外源RSS1P::TiERF1基因具有可遺傳性，僅在根、莖、葉中表達(dá)，以根部表達(dá)量最高，在種子內(nèi)不表達(dá)。紋枯病抗

6、性鑒定和主要農(nóng)藝性狀考察結(jié)果表明，與受體揚(yáng)麥12相比，轉(zhuǎn)RSS1P::TiERF1基因小麥對紋枯病的抗性有明顯提高，與轉(zhuǎn)Ubi::TiERF1基因小麥的抗病性相當(dāng)，而且轉(zhuǎn)RSS1P::TiERF1基因小麥的農(nóng)藝性狀沒有明顯改變，說明可以利用RSS1P啟動子創(chuàng)造更實(shí)用的轉(zhuǎn)基因小麥新種質(zhì)。
　　 （4）構(gòu)建了5個(gè)啟動子GUS融合載體，通過GUS染色技術(shù)對所這些載體瞬間表達(dá)體進(jìn)行分析驗(yàn)證，說明玉米泛素基因的Intron對RSS1P啟動