人MxA基因轉(zhuǎn)基因小鼠及轉(zhuǎn)基因克隆豬的制備與分析.pdf

1、Mx蛋白是Ⅰ型干擾素(IFNα/β)誘導(dǎo)下產(chǎn)生的具有GTPase活性的抗病毒蛋白,對(duì)多種負(fù)鏈RNA病毒具有抵抗力,現(xiàn)已被應(yīng)用到動(dòng)物抗病育種領(lǐng)域中。相關(guān)研究資料表明,開(kāi)展Mx蛋白研究很有科學(xué)意義和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。
　　 人的Mx基因位于第21號(hào)染色體上,人類細(xì)胞在受到Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)后可表達(dá)出兩種Mx蛋白分別為MxA和MxB。其中,MxA蛋白具有廣譜的抗病毒效應(yīng),能保護(hù)機(jī)體免受流感病毒、麻疹病毒、水泡性口炎病毒等的侵染,MxB蛋白無(wú)抗

2、病毒活性。
　　 鑒于MxA基因在抗病毒方面的顯著功效,為進(jìn)一步深入研究MxA蛋白的抗病機(jī)理,為動(dòng)物抗病育種研究奠定基礎(chǔ),本研究采用受精卵原核顯微注射法將本室構(gòu)建的包含人MxA基因cDNA序列的外源片段導(dǎo)入受精卵的原核中,通過(guò)胚胎移植制備了高效表達(dá)人MxA蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠,以研究這些轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)流感病毒的抗病性,并探討了外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物傳代過(guò)程中的遺傳規(guī)律。此外,本研究還通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)制備了攜帶有人MxA基因的轉(zhuǎn)基因克

3、隆豬,為研究MxA蛋白在大動(dòng)物抗病育種中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 在本論文的第二部分介紹了含有人MxA基因全長(zhǎng)cDNA序列的pEGFP-MxA-Cl載體的構(gòu)建,并轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞驗(yàn)證了載體的有效性。
　　 論文第三到第五部分介紹了顯微注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)平臺(tái)的建設(shè),并利用顯微注射的方法構(gòu)建了MxA轉(zhuǎn)基因小鼠。將含人MxA cDNA的質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化并純化后,通過(guò)顯微注射導(dǎo)入到小鼠受精卵的雄原核中,并將注射后狀態(tài)良好的受

4、精卵回輸至假孕受體母鼠的輸卵管中,共獲得55只后代小鼠。PCR鑒定共獲得15只陽(yáng)性鼠,進(jìn)一步對(duì)PCR陽(yáng)性的小鼠基因組DNA做Southern blot鑒定,檢測(cè)出5只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率約為10.9％。PCR和Southern blot雙陽(yáng)性的MxA轉(zhuǎn)基因小鼠與正常ICR小鼠雜交以建立轉(zhuǎn)基因小鼠品系(命名為TG-1、TG-3、TG-4、TG-6和TG-12)。F1代和F2代的PCR鑒定結(jié)果表明,TG-1、TG-3、TG-6和TG-

5、12Founder鼠的轉(zhuǎn)基因可穩(wěn)定遺傳給后代。其中品系TG-6的2只F2經(jīng)測(cè)交實(shí)驗(yàn)證實(shí)為轉(zhuǎn)基因純合子,已完成建系任務(wù)。同時(shí),經(jīng)RT-PCR和Western blot分析,發(fā)現(xiàn)5個(gè)MxA轉(zhuǎn)基因小鼠品系的肺臟中都有MxA蛋白的表達(dá)。對(duì)TG-3的轉(zhuǎn)基因多組織表達(dá)分析表明:在CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下,MxA轉(zhuǎn)基因可在肺臟、脾臟、腎臟、心臟等部位表達(dá)。
　　 論文第六部分利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將來(lái)源于人的MxA基因轉(zhuǎn)染至大白豬胎兒成纖維細(xì)胞中,所

6、用載體為pCMV-eGFP-MxA表達(dá)載體,帶有新霉素抗性(Neomycin,Neo)基因和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)雙篩選標(biāo)記。采用600μg/mL G418藥物濃度連續(xù)10d篩選得到陽(yáng)性克隆細(xì)胞株,經(jīng)PCR鑒定后確定為陽(yáng)性的細(xì)胞作為細(xì)胞核供體與體外成熟42h的豬卵母細(xì)胞構(gòu)建重構(gòu)胚,移入自然發(fā)情的受體豬輸卵管中,經(jīng)過(guò)正常的體內(nèi)發(fā)育過(guò)程,有1頭轉(zhuǎn)基因克隆豬出生。PCR和Southern雜交

7、檢測(cè)結(jié)果顯示:獲得的轉(zhuǎn)基因克隆豬的基因組中整合有MxA基因。
　　 本論文已完成MxA轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因克隆豬模型建立,為在動(dòng)物個(gè)體水平進(jìn)一步深入揭示MxA的抗病機(jī)理奠定了基礎(chǔ),為動(dòng)物抗病育種提供了良好的動(dòng)物模型。
　　 綜合以上結(jié)果可以得出以下結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用顯微注射法成功建立了轉(zhuǎn)人MxA基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
　　 2.由CMV啟動(dòng)子指導(dǎo)的人MxA表達(dá)載體。pEGFP-MxA-C1能夠在轉(zhuǎn)基因小