人血栓調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬的制備及表達鑒定.pdf

1、隨著同種器官移植在臨床上的迅速發(fā)展，使器官需求量日益增加，伴隨而來的同種異體器官的供應(yīng)短缺也日益嚴(yán)重。異種移植是解決這一問題的潛在途徑之一。豬憑借其解剖學(xué)和生理學(xué)上與靈長類高度相似的特點，被作為應(yīng)用于器官移植的一種理想供體動物。近年來α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因(α-1，3-galactosyltransferase-knockout，GT-KO)敲除豬、表達人補體調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)基因豬的出現(xiàn)使得超急性免疫排斥反應(yīng)不再是最主要的問題，異種移植

2、后的凝血障礙更亟待解決。血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin，TM)是存在于血管內(nèi)皮細胞表面的一種具有很強抗凝活性的糖蛋白，可與凝血酶結(jié)合參與蛋白C途徑調(diào)節(jié)凝血，在克服凝血紊亂的研究中起關(guān)鍵作用。
　　本研究采用豬內(nèi)源TM啟動子調(diào)控hTM構(gòu)建表達載體，通過核移植及胚胎移植技術(shù)成功制備了血管內(nèi)皮特異性表達hTM的轉(zhuǎn)基因克隆五指山小型豬，結(jié)果如下:
　　研究一:本研究首先以大白豬TM基因座BAC為模板，通過PCR技術(shù)構(gòu)建抓

3、捕載體PBR322-catch，經(jīng)序列測定，同源性為100％。再利用Red同源重組系統(tǒng)介導(dǎo)的“gap-repair”基因抓捕技術(shù)，從含大白豬TM基因座的BAC(細菌人工染色體)上亞克隆7 kb的TM啟動子，經(jīng)酶切鑒定，大小與預(yù)期一致。
　　研究二:通過PCR技術(shù)獲得表達載體所需各元件的亞克隆片段，經(jīng)T-A克隆，酶切、回收、酶連至克隆載體pBlueScriptⅡ（SK-）中，再將獲得的完全同源的TM啟動子連入表達載體中，構(gòu)建完成含有

4、嘌呤抗性(Puromycin，Puro)的血管內(nèi)皮細胞特異性的表達載體pBS-hTM。
　　研究三:將構(gòu)建完成的抓捕載體經(jīng)Xhol(Ⅰ)線性化后，通過電擊轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細胞系WPF176和WPF169，用含有1.0μg/mL嘌呤霉素篩選培養(yǎng)液進行約10～15天的篩選，共獲得克隆點354個，經(jīng)過PCR鑒定含有15個陰性細胞克隆點。
　　研究四:以其中2個生長狀態(tài)較好的hTM陽性細胞克隆做為供體細胞進行核移植，重構(gòu)胚經(jīng)融合激活后

5、進行體外培養(yǎng)，其體外發(fā)育能力與普通重構(gòu)胚無顯著差異(P＞0.05)。先后將972個重構(gòu)胚移植到5頭受體母豬體內(nèi)，30天后B超檢測懷孕2頭，妊娠120天后共生產(chǎn)仔豬5頭，其中1頭死亡，其余4頭生長狀況良好，無畸形及其他異常狀況。
　　研究五:經(jīng)新生仔豬耳組織基因組PCR鑒定，組織RT-PCR以及Western blot鑒定，5頭仔豬中1頭為陰性，其余4頭均為陽性，且嚴(yán)格遵循血管內(nèi)皮細胞的特異性表達。
　　綜上所述，本研究成功獲