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文檔簡介
1、豬肉是人類攝取動物蛋白的重要來源,優(yōu)質(zhì)豬肉細嫩多汁、口感豐富、肉色鮮紅,而肌內(nèi)脂肪(Intramuscularfat,IMF)含量與其有著極高的關(guān)聯(lián),因此成為評定肉質(zhì)的重要指標。人類對豬的長期遺傳選育投入了很大的人力和物力,更偏重于降低背膘厚度和提高瘦肉率,然而造成了肌內(nèi)脂肪含量的大幅下降,甚至高瘦肉型豬IMF含量降到了1.5%(建議范圍:2.5%-3%),導(dǎo)致豬肉品質(zhì)下降、口感變差,因此今后的選育方向轉(zhuǎn)變成在確保瘦肉率的同時增加IMF
2、含量。研究表明,肌內(nèi)脂肪含量的提高即意味著甘油三酯(triglycerol,TAG)含量的提高。DGAT1限速酶催化甘油三酯合成反應(yīng)的最后一步,在哺乳動物的脂類代謝中發(fā)揮著重要作用。因此,本研究以二?;视王;D(zhuǎn)移酶1作為候選基因,構(gòu)建了肌肉特異性真核表達載體sMCK-sDGAT,通過顯微注射和體細胞克隆分別獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬,以研究肌肉超表達DGAT1的效果和影響,為今后的研究提供材料并奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究成果有:
3、 1、根據(jù)基因重組的原理,從豬MCK基因的細菌人工染色體中,獲得了MCK基因長度為7261個堿基的啟動子序列。以真核表達載體pEGFP-N1為框架去除GFP基因后,連接MCK基因啟動子和人工合成的DGAT1基因全長CDS,構(gòu)建肌肉特異性超表達DGAT1的真核表達載體sMCK-sDGAT1。采用PCR、酶切和測序的方式進行鑒定,證明最終構(gòu)建的載體準確無誤。
2、通過顯微注射法將線性化sMCK-sDGAT1注射進入小鼠受
4、精卵的雄原核,我們得到了16只陽性轉(zhuǎn)基因Founder鼠(委托上海南方模式生物科技有限公司),陽性公鼠與陰性C57BL/6J母鼠交配后獲得F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。采用半定量檢測二月齡和四月齡小鼠的DGAT1基因表達量,進行組織表達譜的研究,結(jié)果表明相較于陰性小鼠,DAGT1基因在陽性小鼠的骨骼肌和腎臟內(nèi)高表達,在心肌內(nèi)中等表達,而在腦,肺,腸等組織內(nèi)很少表達。上述結(jié)果說明MCK基因啟動子能夠驅(qū)動DGAT1基因在哺乳動物體內(nèi)表達,與對哺乳動
5、物各個組織內(nèi)MCK基因表達的研究結(jié)果是一致的。
3、我們通過實時定量PCR檢測了骨骼肌中參與脂肪合成和轉(zhuǎn)運等相關(guān)基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)部分基因的表達發(fā)生變化,如質(zhì)體乙酰輔酶羧化酶1(ACC1)的mRNA增加34%(p<0.01),脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP4)增加53%(p<0.01),脂肪酸合成酶(FAS)增加74%(p<0.01),乙烯前體ACC合成酶1(ACS1)增加62%(p<0.01),骨骼肌中的棕色脂肪特異基因UC
6、P1也增加了74%(p<0.01)。WestenBlot的實驗結(jié)果表明,DGAT1、ACC1、FABP4和UCP1的蛋白水平也相應(yīng)的提高了。連續(xù)十周測定轉(zhuǎn)DGAT1陽性小鼠與陰性小鼠的體重,數(shù)據(jù)顯示二者差異不顯著,說明特異性增加IMF含量,并不會導(dǎo)致小鼠其它組織脂肪的過度沉積和肥胖。測定轉(zhuǎn)DGAT1陽性小鼠骨骼肌中的甘油三酯和脂肪酸,發(fā)現(xiàn)二者相對于陰性小鼠分別增加了35.5%(p<0.01)和20.3%(p<0.01)。
7、4、培養(yǎng)了豬30日齡胚胎的原代成纖維細胞系,用電擊轉(zhuǎn)染法將線性化的sMCK-sDGAT1片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進豬的成纖維細胞,經(jīng)G418篩選并進行PCR檢測后獲得陽性單克隆,作為體細胞核移植的供體細胞制備了轉(zhuǎn)基因豬。
5、通過PCR及SouthernBlot檢測確定獲得了一頭原代陽性轉(zhuǎn)基因豬,內(nèi)參基因為GAPDH,使用實時熒光定量PCR法檢測外源基因DGAT1基因的拷貝數(shù),并通過計算繪制標準曲線,公式為Log2N(拷貝數(shù))=-0.
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