豬Angptl家族基因的克隆、表達(dá)及調(diào)控研究.pdf

1、血管生成素相關(guān)蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的一族不僅與血管生成有關(guān)，而且與脂類(lèi)代謝、葡萄糖代謝和胰島素敏感性密切相關(guān)的分泌性蛋白質(zhì)因子。它們屬于纖維蛋白原超家族，具有同血管生成素相似的結(jié)構(gòu)特征，即N端的信號(hào)肽序列，介導(dǎo)同源寡聚體形成的螺旋樣結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)配體活性的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。但是，血管生成素樣蛋白不能與 Tie2 受體結(jié)合，所以他們不是真正意義上的血管生成素，故命名為血管生成素相關(guān)蛋白(ARP)/血管生成素樣蛋白(Angptl)。 本文

2、以梅山豬為材料克隆了豬 Angptl家族的5個(gè)基因，并利用輻射雜種細(xì)胞板技術(shù)和半定量 RT-PCR等方法進(jìn)行了染色體定位和組織表達(dá)分析；同時(shí)研究了它們?cè)谥拘拓i(通城豬)和瘦肉型豬(長(zhǎng)白豬)組織中的表達(dá)差異；最后以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)行了表達(dá)調(diào)控的初步研究，得到如下結(jié)果： 1、利用RT-PCR、5’RACE和3’RACE方法，擴(kuò)增并拼接得到 Angptls全編碼區(qū)的cDNA序列，其中 Angptl1編碼區(qū)為1476bp，

3、編碼491個(gè)氨基酸；Angptl2 編碼區(qū)為1482bp，編碼493個(gè)氨基酸；Angptl3編碼區(qū)為1389bp，編碼462個(gè)氨基酸；Angpd4編碼區(qū)為1239bp，編碼412個(gè)氨基酸；Angptl6編碼區(qū)為1362bp(非全編碼區(qū)，缺5’端約30個(gè)堿基)，編碼453個(gè)氨基酸。 2、根據(jù)已擴(kuò)增的豬 Angptls的cDNA序列和人 Angptls的基因序列及mRNA 序列，分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增 Angptls 內(nèi)含子的基因片斷。再

4、根據(jù)所測(cè)內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)引物，利用輻射雜種板技術(shù)對(duì)這5個(gè)基因進(jìn)行染色體定位，結(jié)果表明它們分別定位在4條染色體上，其中 Angptl4和 Angptl6定位于2號(hào)染色體的同一區(qū)域。上述5個(gè)基因的定位結(jié)果皆與人基因組中相應(yīng)基因的染色體位置相對(duì)應(yīng)。 3、以梅山豬的脂肪組織、骨骼肌、心、胃、肝、肺、脾、腸、腦、腎十個(gè)組織樣品為材料，用半定量RT-PCR的方法研究了 Angptls的組織表達(dá)譜。結(jié)果表明Angptl1、Angptl2和 An

5、gptl4是廣譜表達(dá)，其中 Angptl1 在脂肪組織、胃和脾中表達(dá)量最高，Angptl2在脂肪組織和腸中高效表達(dá)，Angptl4在脂肪組織中表達(dá)最豐富。而Angptl3和 Angptl6主要在肝臟中表達(dá)，另外，Angptl6在脂肪組織、胃、腸和腦組織中也有微量表達(dá)。 4、以脂肪型豬(通城豬)和瘦肉型豬(長(zhǎng)白豬)的組織樣品為材料，對(duì) Angptls在兩種不同類(lèi)型豬中的組織表達(dá)差異進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示 Angptl1 和 Angp

6、tl2 基因在通城豬肝臟和心臟中的表達(dá)量高于長(zhǎng)白豬的相應(yīng)組織，而在通城豬脂肪組織中的表達(dá)量卻低于長(zhǎng)白豬脂肪組織；Angptl3 在通城豬肝臟中的表達(dá)量高于長(zhǎng)白豬；Angptl4基因在通城豬肝臟和脂肪組織中的表達(dá)量均高于長(zhǎng)白豬的相應(yīng)組織：Angptl6基因在通城豬肝臟的表達(dá)量低于長(zhǎng)白豬。 5、以人肝瘤細(xì)胞系HepG2為材料，研究葡萄糖、胰島素、克倫特羅和地塞米松對(duì) Angptls的調(diào)控作用。結(jié)果表明，高濃度葡萄糖(25mmol/L

7、、50 mmol/L 和100mmol/L) 處理顯著升高 Angptl4 mRNA的表達(dá)，降低 Angptl6 mRNA的表達(dá)量。胰島素處理顯著抑制Angptl3、Angptl4、Angptl6的表達(dá)量。當(dāng)用相同濃度胰島素(100nmol/L) 和不同濃度葡萄糖處理時(shí)，Angptls 表達(dá)量的變化趨勢(shì)與不同濃度葡萄糖處理的變化趨勢(shì)相似。克倫特羅處理增加 Angptl3和ChREBP mRNA的表達(dá)。地塞米松處理顯著增加 Angptl4