大豆CBL基因家族的表達(dá)分析及部分基因的克隆與定位.pdf

1、土壤鹽堿化、干旱和低溫等逆境脅迫已經(jīng)成為制約農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素，并且對(duì)農(nóng)業(yè)的發(fā)展及糧食的保障產(chǎn)生了很不利的影響。大豆是主要的經(jīng)濟(jì)作物，逆境脅迫嚴(yán)重影響大豆的長(zhǎng)勢(shì)，因而，提高大豆對(duì)逆境脅迫的耐受力，是提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)、保障糧食安全的根本途徑。CBL基因家族是主要的鈣離子感受器，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮重要的作用。目前關(guān)于大豆CBL基因家族的研究甚少，因此，深入挖掘大豆CBL基因家族中響應(yīng)逆境脅迫的功能基因，對(duì)解析大豆響

2、應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制及大豆抗逆新品種的遺傳改良具有重要意義。
　　本研究以大豆品種“黑農(nóng)52”為材料，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了高鹽、低鉀、干旱、低溫脅迫和ABA激素誘導(dǎo)條件下大豆CBL基因家族的表達(dá)模式及在正常生長(zhǎng)條件下不同組織的表達(dá)模式;并分析了該基因家族的生物信息學(xué)特征;通過(guò)同源克隆技術(shù)，從大豆中克隆了與擬南芥AtCBL4、AtCBL6基因同源的GmCBL4和GmCBL6基因，并構(gòu)建了GmCBL4基因的植物過(guò)表達(dá)載體，

3、為GmCBL4基因的功能研究奠定基礎(chǔ);同時(shí)構(gòu)建了GmCBL4基因與GFP基因的融合表達(dá)載體，通過(guò)亞細(xì)胞定位技術(shù)分析了GmCBL4基因在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。獲得的研究結(jié)果如下:
　　1.GmCBL基因家族在逆境脅迫和激素誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析
　　組織特異性表達(dá)模式分析表明，GmCBL1、GmCBL2、GmCBL4、GmCBL8相對(duì)表達(dá)量在根中最高，GmCBL6在成熟葉片中最高，GmCBL10在莖中最高。逆境脅迫及激素誘導(dǎo)下的表達(dá)

4、模式分析表明，大豆CBL基因家族對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)均呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，GmCBL1、GmCBL6在高鹽、干旱、低溫的誘導(dǎo)下表達(dá);GmCBL2主要響應(yīng)低溫脅迫的誘導(dǎo);GmCBL4響應(yīng)高鹽、低鉀、干旱和ABA的誘導(dǎo);GmCBL8主要響應(yīng)高鹽的誘導(dǎo);GmCBL10對(duì)多種脅迫和ABA的誘導(dǎo)表達(dá)變化不明顯。
　　2.GmCBL基因家族的生物信息學(xué)分析
　　通過(guò)擬南芥CBLs基因序列在大豆數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得6個(gè)大豆CBL基因家族成員，

5、其蛋白序列長(zhǎng)度在213～263個(gè)氨基酸之間，等電點(diǎn)范圍均在5.20左右。染色體定位分析顯示，GmCBL8、GmCBL1、GmCBL4、GmCBL10、GmCBL2、GmCBL6分別位于大豆4、5、6、7、8、17號(hào)染色體上。GmCBL基因家族氨基酸序列多重比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，該家族成員均含有3個(gè)典型的EF-hand保守結(jié)構(gòu)域，并且在GmCBL1、GmCBL4、GmCBL8中具有膜定位功能的N-豆蔻?；Y(jié)構(gòu)域(MGCXXSK/T)。

6、GmCBLs基因外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明，該基因家族每個(gè)成員均分別含有8-9個(gè)外顯子和內(nèi)含子。GmCBLs與擬南芥、水稻、玉米和高粱中CBL家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GmCBLs與擬南芥CBLs的親緣關(guān)系最近。
　　3.GmCBL4、GmCBL6基因的克隆與序列分析
　　通過(guò)PCR從大豆中擴(kuò)增得到了GmCBL4、GmCBL6基因，其CDS序列長(zhǎng)度分別為672bp和681bp，分別編碼223個(gè)氨基酸和226個(gè)氨基酸，均具有典型

7、的EF hand結(jié)構(gòu)域。Neighbor-joining進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，GmCBL4、GmCBL6蛋白分別與野生大豆（Glycine soja）、紅豆（Vigna angularis）中同源蛋白的親緣關(guān)系最近。
　　4.GmCBL4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建與亞細(xì)胞定位分析
　　構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體pBI121-GmCBL4和亞細(xì)胞定位表達(dá)載體pCAMBIA1302-GFP-GmCBL4，亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，GmCBL4定