豬BMP-3b基因克隆及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、肌肉和脂肪是影響豬肌肉品質(zhì)重要因素，提高肌肉品質(zhì)是育種工作者的重要目標(biāo)之一，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，豬的育種技術(shù)已從常規(guī)育種逐漸向分子育種的方向過渡。因此，了解影響豬肌肉和脂肪組織的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理，有助于為分子育種打下良好的基礎(chǔ)。為此，我們做了如下研究:
　　 (1)通過5'ACE鑒定了豬BMP-3b基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，發(fā)現(xiàn)該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點翻譯起始位點上游278bp處的鳥嘌呤，并將其定為+1。
　　 (2)通過

2、NCBI和EBI獲得了豬BMP-3b基因5'端上游調(diào)控序列，我們克隆了該基因5'端上游調(diào)控序列1458bp。利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測了豬BMP-3b基因5'端上游調(diào)控區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了TATA-box和GC-box，預(yù)測到了多個與脂肪相關(guān)的C/EBP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。并比較不同物種的近端啟動區(qū)，發(fā)現(xiàn)在-51～-36bp處高度保守，該區(qū)域位于兩個GC-box中。
　　 (3)構(gòu)建了8段5'端系列缺失片段的雙熒光素酶報告基因載體，并在3種

3、真核細(xì)胞系中檢測了它們的熒光活性，并對活性較高的PF2段缺失又進(jìn)行了5段缺失，同樣檢測它們的熒光活性，發(fā)現(xiàn)在-46～-39可能是該基因的核心區(qū)域。
　　 (4)通過點突變的方法對上述找到的核心區(qū)域進(jìn)行了突變驗證，發(fā)現(xiàn)突變后其熒光活性極顯著降低，進(jìn)一步確定了該基因的核心位點。
　　 (5)豬BMP-3b基因5'端上游和第一外顯子存在著兩個CpG島，分別位于-354～+229處，長度為583bp;+308～+596bp，長度

4、為288bp;我們對該基因9個不同組織和時期的核心啟動區(qū)-277～-18bp進(jìn)行了甲基化分析。該區(qū)域存在37個CG位點。發(fā)現(xiàn)豬BMP-3b基因的甲基化水平很低，在1月齡背最長肌甲基化程度最高，但也僅為3.2％;在6月齡胃中最低，僅有0.3％。
　　 (6)運用RT-PCR的方法檢測了BMP-3b基因在六月齡大白豬16個組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:該基因在腦和肺中高表達(dá)，在脂肪、肝臟、心臟、卵巢中中度表達(dá)，在脾臟、背最長肌、胃、小腸

5、、腎臟中微量表達(dá)，在所檢測的其他組織中未檢測到表達(dá)。
　　 (7)分別獲取了大白豬和梅山豬BMP-3b基因的完整CDS，全長為1428bp，編碼475個氨基酸，對比發(fā)現(xiàn)在546bp處梅山豬為A，而大白豬為G，但由于密碼子的搖擺性，CTA(G)編碼相同的亮氨酸，該位點可能是一個潛在的SNP位點。并由此構(gòu)建了PcDNA3.1-CDS真核表達(dá)載體。
　　 (8)運用生物信息學(xué)的方法對比了不同物種的BMP-3b基因結(jié)構(gòu)和的氨基酸

6、序列，發(fā)現(xiàn)BMP-3b是一個很保守的基因，豬、牛、鼠和人的該基因都具有三個外顯子和二個內(nèi)含子，而且內(nèi)含子和外顯子的交界處均符合GT-AG的典型規(guī)則;豬和牛、羊、馬、貓、黑猩猩、大熊貓、人、鼠的氨基酸序列相似性分別為92％、93％、94％、89％、90％、92％、90％、90％。
　　 (9)利用構(gòu)建PcDNA3.1-CDS真核表達(dá)載體在豬PK細(xì)胞中進(jìn)行了超表達(dá)分析，通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn):超表達(dá)豬BMP-3b基因后與空PcDNA