湖羊BMP7啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、前期在湖羊羔皮毛囊中利用基因芯片技術(shù)篩選出不同花紋間差異表達(dá)基因BMP7，結(jié)合湖羊羔皮毛囊組織學(xué)特性關(guān)聯(lián)分析，確定BMP7作為候選基因，BMP7蛋白是TGF-β超家族中最大的分泌型信號(hào)傳導(dǎo)分子之一，BMP7除了與骨形成發(fā)生有關(guān)，還被發(fā)現(xiàn)與羽毛胚芽的大小和空間分布有關(guān)，在毛囊的發(fā)育與毛發(fā)生的生長中起著重要作用，但本身的調(diào)控機(jī)制并不清楚。為此，本研究對(duì)BMP7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步研究，首先對(duì)湖羊不同組織進(jìn)行BMP7表達(dá)水平分析，其次克隆B

2、MP7近端啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，接著根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果與近端啟動(dòng)子序列構(gòu)建系列缺失載體雙熒光素活性檢測(cè)，最后對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變和轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)驗(yàn)證，從而揭開BMP7啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)的研究提供依據(jù)。本研究主要通過以下幾個(gè)方面研究BMP7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制:
　　(1)利用RT-qPCR對(duì)BMP7在湖羊的各個(gè)組織表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在羔皮毛囊組織中高表達(dá)。
　　(2)通過NCBI數(shù)據(jù)庫得到BMP7轉(zhuǎn)錄

3、起始點(diǎn)上游大約2000bp下游500bp的調(diào)控序列，以2500bp的序列為基礎(chǔ)進(jìn)行近端啟動(dòng)子克隆，獲得了1757bp的序列。對(duì)BMP7近端啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)在BMP7近端啟動(dòng)子上游調(diào)控區(qū)存在-1216bp—-1166bp與-632bp—-582bp兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);對(duì)CpG島分布情況分析，發(fā)現(xiàn)-549bp—+295bp處富含CpG島，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有SP1、EGR1、NRF1、TFAP2

4、B等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　(3)根據(jù)BMP7近端啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子系列缺失片段，將各個(gè)缺失片段構(gòu)建到雙熒光素酶報(bào)告基因載體上，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行雙熒光酶檢測(cè)不同缺失片段活性并進(jìn)行顯著性比較，尋找雙熒光素酶活性最高的序列片段，發(fā)現(xiàn)核心區(qū)域-758bp—-545bp之間活性較高，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在轉(zhuǎn)錄因子SP1、EGR1可能結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)BMP7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控起著一定作用。
　　(4)為了進(jìn)一步鑒定BMP7近端