HGF啟動子區(qū)轉錄調控元件截短改變與胃癌發(fā)生相關性研究.pdf

1、胃癌是源自胃粘膜上皮的惡性腫瘤,在我國發(fā)病率很高,死亡率占惡性腫瘤的第一位。胃癌是多種基因變化參與和積累的結果,揭示這些基因變化的規(guī)律,不僅可以闡明癌變的機制,更可以協(xié)助腫瘤的診斷、治療和預后判斷。
　　 肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)主要由間質細胞如成纖維細胞、巨噬細胞等產生,是一種上皮形態(tài)發(fā)生過程中的旁分泌調節(jié)物,具有多種生物學特性,能刺激多種上皮和內皮細胞進行有絲分裂、運動以及促

2、進腎小管形態(tài)發(fā)生和血管內皮再生。HGF生物學活性由原癌基因c.met編碼的跨膜受體蛋白所介導。研究發(fā)現(xiàn)HGF/c-Met通路異常活化在腫瘤生長、侵襲和轉移中起重要作用。在許多上皮源性腫瘤中常可測得HGF過度表達,乳腺癌患者組織和血液中HGF表達水平顯著高于非乳腺癌患者,出現(xiàn)淋巴結或肝轉移者表達水平最高,而且HGF和c-Met表達水平與腫瘤的復發(fā)有關。對HGF異常表達的人類乳腺癌細胞系的HGF啟動子區(qū)1kb范圍內序列突變篩查研究發(fā)現(xiàn),HG

3、F的異位表達和可誘導表達的分子基礎是HGF基因轉錄起始點上游一個cis作用元件DNA序列的改變。野生型cis作用元件是30個脫氧腺苷酸(A)形成的PolyA結構,將這個PolyA結構命名為DATE(deoxyadenosine tract element,DATE),當DATE發(fā)生截短改變,就會改變某些轉錄因子如C/EBP-β1、PAPP1和PAPP2對HGF啟動子區(qū)DATE及臨近結合位點的結合力,增加HGF啟動子的活性,促進其在腫瘤細

4、胞中表達。研究發(fā)現(xiàn)復發(fā)性胃癌患者血清HGF顯著高于正常人和原發(fā)性胃癌者,且HGF水平與腫瘤浸潤深度及血管受侵程度密切相關,在胃癌中,胃纖維母細胞通過激活HGF/c-Met系統(tǒng)來刺激腫瘤的生長和浸潤。胃癌中常可見到c-Met的擴增和過度表達,因此,HGF/c-Met與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后密切相關。
　　 為探討HGF的DATE截短改變是否與胃癌發(fā)生相關,我們檢測了胃癌細胞系和80例胃癌患者HGF啟動子區(qū)DATE截短改變情況

5、,并進一步用RT-PCR檢測HGF的DATE發(fā)生截短改變后,HGF相應胃癌細胞系和胃癌組織中的表達,明確二者的相關性,為胃癌的診斷和治療開辟一個新思路。
　　 材料與方法：
　　 1、胃癌細胞系、胃癌組織和正常人外周血HGF的DATE截短篩查
　　 常規(guī)酚氯仿法提取胃癌細胞系、80例胃癌組織及相應癌旁組織和100例正常人外周血基因組DNA,通過PCR反應擴增HGF啟動子區(qū)DATE序列,產物經8％的變性聚丙烯酰胺凝

6、膠電泳檢測,檢測到DATE截短改變的標本進行TA克隆測序驗證,HeLa細胞系DATE的PolyA數目是30,與正常人基因組DATE序列相同,將HeLa細胞DATE作為野生型,與野生型DATE相比,胃癌細胞系、胃癌組織和正常人DATE的PolyA缺失大于等于5A,定義為DATE出現(xiàn)截短改變。
　　 2、RT-PCR檢測胃癌細胞系和胃癌組織中腳表達
　　 5種胃癌細胞系和30例胃癌組織和相應癌旁組織用TRIzol法提取總RN

7、A后,反轉錄合成cDNA,RT-PCR檢測HGF表達,明確DATE截短改變與HGF表達的關系。
　　 3、DATE截短改變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的相關性分析
　　 選取微衛(wèi)星位點D5S396和D5S2056,PCR擴增發(fā)生DATE截短改變的6例胃癌組織和相應癌旁組織的2個微衛(wèi)星位點,比較胃癌組織DATE截短改變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象之間的相關性。
　　 實驗結果
　　 1、胃癌細胞系腳啟動子區(qū)DATE截短改變和腳表

8、達關系
　　 本研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞系MGC803、MKN28和HGC27發(fā)生了DAFE截短改變,基因型分別是30A/25A、25A/25A和27A/25A。胃粘膜上皮細胞系GES-1和胃癌細胞系SGC7901、BGC823和AGS DATE沒有截短改變。
　　 RT-PCR檢測HGF在胃粘膜上皮細胞系GES-1及胃癌細胞系SGC7901、MGC803、BGC823和AGS中表達,發(fā)現(xiàn)HGF只在DATE出現(xiàn)截短改變的MGCS

9、03中表達,DATE沒有截短改變的細胞系中沒有表達,這表明HGF啟動子區(qū)DATE的截短改變促進了HGF在胃癌細胞系的表達。
　　 2、胃癌組織中HGF啟動子區(qū)DATE截短改變和HGF表達關系
　　 本研究檢測了80例胃癌組織及相應癌旁組織中HGF啟動子區(qū)DATE的截短改變情況。發(fā)現(xiàn)15％(12/80)的胃癌患者存在DATE的截短改變。胃癌組織DATE的PolyA的截短變化范圍從5A～20A。在12例DATE截短改變的胃癌

10、樣本中,7例(58％)DATE截短改變只發(fā)生在胃癌組織,而相應癌旁組織DATE沒有截短改變,其余5例DATE截短改變同時存在于癌組織和癌旁組織,提示DATE的截短改變與胃癌發(fā)生密切相關。
　　 RT-PCR檢測HGF在30例胃癌組織中表達情況,發(fā)現(xiàn)只在DATE截短改變的6例(占20％)胃癌組織中有HGF表達,而未出現(xiàn)截短改變的胃癌組織和癌旁組織未見HGF表達。且DATE截短最多的標本(其癌組織DATE基因型20A/10A),HG

11、F表達最高,以上結果提示HGF表達水平與DATE截短程度相關。
　　 3、HGF啟動子區(qū)DATE截短改變與胃癌發(fā)生相關性分析
　　 研究中發(fā)現(xiàn)DATE在相應癌旁組織中也出現(xiàn)截短改變,提示DATE的截短改變具有多態(tài)性。分析了100例中國正常人群外周血中HGF啟動子區(qū)DATE截短改變情況,發(fā)現(xiàn)4％(4/100)的人群中出現(xiàn)DATE截短改變。比較胃癌患者和正常人群中DATE截短發(fā)生率,x2檢驗顯示兩者差別有統(tǒng)計學意義(P<0.

12、05),表明DATE截短與胃癌發(fā)生相關。
　　 4、DATE截短改變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關性分析
　　 為了確定DATE在腫瘤組織中的不穩(wěn)定現(xiàn)象和腫瘤組織中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性之間的相關性,PCR擴增已確定DATE截短改變的6例胃癌組織和癌旁組織的D5S396和D5S2056微衛(wèi)星位點,發(fā)現(xiàn)5例在D5S396和D5S2056兩個位點都出現(xiàn)了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性,一例未檢測到微衛(wèi)星不穩(wěn)定性,這例標本癌旁組織和癌組織DATE出現(xiàn)相同程度的

13、截短改變。這表明通過分析胃癌組織DATE截短改變可以判定胃癌組織發(fā)生了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變,以上提示HGF啟動子區(qū)DATE可作為篩查胃癌組織微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的一個簡單而有效的指標。
　　 結論：
　　 (1)胃癌中存在HGF啟動子區(qū)DATE的截短改變,DATE的截短改變能促進HGF在胃癌中的表達,表明DATE的截短改變與胃癌發(fā)生密切相關。
　　 (2)胃癌中DATE的截短改變,能有效判定胃癌組織發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象,