LTF基因在胃癌內(nèi)的表達及其啟動子區(qū)甲基化相關性探索.pdf

1、目的:
　　胃癌是全世界范圍內(nèi)癌癥導致死亡的最常見原因之一。其腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制主要涉及遺傳性因素改變和表觀遺傳學因素改變的堆積。而后者主要包含DNA甲基化，雜合性丟失以及組蛋白修飾三方面。近來有很多的文獻證明在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中DNA啟動子區(qū)甲基化這一機制占有重要的地位。新近研究發(fā)現(xiàn)LTF基因有抑癌作用，其在多種腫瘤里表現(xiàn)為低表達和表達缺失，且機制與LTF啟動子區(qū)異常高甲基化相關。本實驗中我們主要研究一下內(nèi)容:
　　

2、1.檢測胃癌組織及四種胃癌細胞株(SGC7901,MGC803，BGC823，AGS）內(nèi)LTF基因的mRNA表達情況，了解該四種胃癌細胞株內(nèi)LTF表達水平，分析目的基因LTF表達與胃癌臨床病理特征的關系。
　　2.檢測目的LTF基因在胃癌組織及相應的四種細胞株中的啟動子甲基化情況，探索其DNA甲基化情況和LTF在胃癌里表達水平的相關性。
　　3.四種胃癌細胞株用去甲基化劑5-aza-CdR處理后，分別檢測LTF基因mRNA，

3、蛋白表達水平及其啟動子區(qū)甲基化率的改變。分析5-aza-CdR對胃癌細胞株甲基化率的作用，進一步深入研究LTF基因表達和其啟動子區(qū)甲基化的關系。
　　方法:
　　1.用亞硫酸氫鹽測序方法(bisulfite genomic sequencing PCR，BSP)檢測胃癌組織和胃癌細胞株(SGC7901，MGC803，BGC823，AGS)的LTF基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　2.胃癌組織和四種胃癌細胞株內(nèi)LTF的mRN

4、A表達水平使用熒光定量PCR方法(Realtime PCR)檢測。
　　3.四種胃癌細胞株內(nèi)LTF基因的蛋白表達水平使用蛋白印跡法(Western blot)檢測。
　　4.用去甲基化劑5-aza-CdR處理四種胃癌細胞株，我們按不同的藥物濃度分為三組，0μmol/L，2μmol/L，10μmol/L，以0μmol/L為對照組，余濃度為藥物處理組。培養(yǎng)5天后，分別檢測LTF基因的mRNA，蛋白表達及啟動子甲基化率。
　

5、　結果:
　　1.在胃癌組織內(nèi)LTF的mRNA相對表達(2-ΔΔCt)的平均值為0.752，較癌旁正常低(癌旁正常組織設定為1.00)(P＜0.05)。LTF基因在4個胃癌細胞株內(nèi)表達亦是降低(P＜0.001)，結果與胃癌組織內(nèi)一致。胃癌里LTF表達與患者年齡，性別，淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤大小等臨床特征無統(tǒng)計學相關性(P＞0.05)。
　　2.胃癌組織(38.21％)中LTF基因啟動子區(qū)甲基化率明顯高于癌旁正常對照(18.10％)，

6、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.5-aza-CdR處理四種胃癌細胞株5天后，SGC7901，MGC803，BGC823各藥物處理組較對照組總體甲基化率下降(P＜0.05)，且LTF表達較對照組升高(P＜0.05)，但兩個藥物處理組間的總體甲基化率和LTF表達差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，即這三種胃癌細胞株對5-aza-CdR去甲基化作用不存在濃度依賴。胃癌細胞株AGS在藥物處理前后LTF的mRNA表達和啟動子區(qū)總體甲

7、基化率無統(tǒng)計性差異(P＞0.05)。
　　4.去甲基化劑作用于3種胃癌細胞株(SGC7901，MGC803，BGC823)后，LTF基因啟動子區(qū)包含的14個CpG位點各甲基化率改變是不一樣的。在胃癌細胞株SGC7901內(nèi)3，9，10和11號這四個CpG位點甲基化率下降有統(tǒng)計學意義，在MGC823中3，4，5，10，11，12，13號這七個CpG位點有統(tǒng)計學意義，在BGC823中僅有3和8號CpG位點改變有統(tǒng)計學意義。其余位點的甲基