EpCAM與肝腫瘤發(fā)生相關(guān)性研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Primary Hepatocellular Carcinoma，PHC)是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病具有隱匿性、癥狀不典型、早期診斷困難和五年生存率低的特點(diǎn)。每年全世界PHC新發(fā)病例約60多萬，其中超過50％的PHC與乙肝病毒(Hepadds B Virus，HBV)感染有關(guān)；而我國是乙肝的高發(fā)地區(qū)，每年新發(fā)肝癌病例占全球新發(fā)病例的55％，且以中壯年男性高發(fā)。因此，PHC已不僅成為一個(gè)極其嚴(yán)重的國際公共衛(wèi)生問題，也是危害我

2、國人民健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一。目前，PHC的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全研究清楚。按照腫瘤干學(xué)說的理論，腫瘤的形成發(fā)展不是由一群具有均質(zhì)特性的細(xì)胞所產(chǎn)生，而是由腫瘤組織中很少的一部分富有廣泛增殖和形成腫瘤能力的腫瘤干細(xì)胞引發(fā)，并且這群細(xì)胞具有逃逸免疫監(jiān)視和免疫防御的能力，從而在臨床放療、化療過程中不會(huì)被殺滅而保留下來。因此，相比目前采用的殺死腫瘤細(xì)胞或縮小腫塊等一系列并不能徹底治愈腫瘤的治療方法，腫瘤干細(xì)胞概念的提出為腫瘤的治療帶來了新

3、的觀點(diǎn)和希望。
　　 上皮細(xì)胞黏附分子(EpitheliaI cell adhesion molecule，EpCAM)是一種上皮細(xì)胞跨膜糖蛋白，最早作為腫瘤相關(guān)抗原被發(fā)現(xiàn)，因其在各種類型疾病的腫瘤組織中高水平表達(dá)，引起了特別的關(guān)注。目前大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)EpCAM可以作為診斷和治療腫瘤的標(biāo)記蛋白，許多從原發(fā)性肝腫瘤組織中分離建系的人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系中含有EpCAM的表達(dá)，并且這種表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的某些典型特性，尤其對腫

4、瘤發(fā)生和發(fā)展具有決定性的作用，因此推測EpCAM是篩選腫瘤干細(xì)胞的潛在標(biāo)志。所以本文選擇EpCAM作為研究指標(biāo)分析其在原發(fā)性肝癌形成中的意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究主要包括兩個(gè)部分。第一部分是將本教研室建立的肝癌細(xì)胞系P2—HCC與本教研室保存的肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC7721，進(jìn)行比較EpCAM的表達(dá)水平與EpCAM+細(xì)胞表達(dá)量的差異。首先，通過RT—PCR的方法在RNA水平檢測了肝癌細(xì)胞系P2—HCC細(xì)胞EpCAM基因的表

5、達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在P2—HCC細(xì)胞中為顯著高水平表達(dá)。其次，F(xiàn)ACS分析檢測發(fā)現(xiàn)P2—HCC細(xì)胞中EpCAM+陽性細(xì)胞比例明顯較高，比例高達(dá)80％左右。然后，采用細(xì)胞免疫化學(xué)的方法分析發(fā)現(xiàn)EpCAM蛋白同樣在P2—HCC肝癌細(xì)胞系高表達(dá)，表達(dá)區(qū)域?yàn)榧?xì)胞膜上。最后，對臨床原發(fā)性肝癌標(biāo)本通過FACS檢測分析和RT—PCR檢測分析了，從而在組織水平再次驗(yàn)證了EpCAM+細(xì)胞比例和EpCAM表達(dá)水平的差異，該結(jié)果提示EpCAM+細(xì)胞和EpCAM高表達(dá)

6、的細(xì)胞與腫瘤發(fā)生和臨床診斷之間存在相關(guān)性。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn)主要是以EpCAM作為分選指標(biāo)，分別從肝癌細(xì)胞系P2—HCC、HepG2和原發(fā)性肝癌手術(shù)后標(biāo)本中通過磁珠分選獲得了EpCAM+細(xì)胞，以及將分選后細(xì)胞進(jìn)行了致瘤實(shí)驗(yàn)，證實(shí)P2—HCC和HepG2肝癌細(xì)胞系中的EpCAM+細(xì)胞的確能夠在NOD/SCID(nonobese diabetiC/Severe combined immunodeficient)小鼠體內(nèi)行成腫瘤，并

7、且在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤特性存在差異。根據(jù)目前的研究認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”是通過異體移植后能夠在受體中形成與原發(fā)腫瘤類型完全相同的腫瘤能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步印證了EpCAM作為肝腫瘤干細(xì)胞潛在標(biāo)志和作為肝癌惡性程度指標(biāo)的可能性。
　　 通過對肝癌細(xì)胞系P2—HCC、HepG2中EpCAM的表達(dá)和原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中EpCAM的表達(dá)與腫瘤發(fā)生相關(guān)性進(jìn)行深入對比實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明：(1)本教研室建立的肝癌細(xì)胞系P