皮膚黑素瘤細胞IGFBP7基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化的研究.pdf

1、皮膚黑素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤，其發(fā)病機制仍未完全闡明。近來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因胰島素樣生長因子結合蛋白7（insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7）的表達受抑制是黑素瘤發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)，抑癌基因的表達異常與DNA異常甲基化相關，本課題的目的是研究皮膚黑素瘤細胞中IGFBP7基因的表達調控機制，重點闡明啟動子區(qū)CpG島異常甲基化對IGFBP7基因表達調控的影響。

2、　　 1 IGFBP7在皮膚黑素瘤組織和人黑素瘤細胞株中的表達
　　 應用免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，IGFBP7蛋白在原發(fā)性皮膚黑素瘤和轉移性黑素瘤組織中陽性表達率明顯低于普通良性色素痣組織，有顯著性差異。應用半定量RT-PCR和免疫細胞化學法檢測發(fā)現(xiàn)，IGFBP7mRNA和蛋白在人黑素瘤細胞株A375、M14和SK-MEL-1中均陰性表達，在原代黑素細胞和人黑素瘤細胞株MV3中陽性表達。結果顯示，IGFBP7在皮膚黑素瘤組織和人黑

3、素瘤細胞株中表達抑制。
　　 2人黑素瘤細胞株IGFBP7基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化的研究
　　 應用亞硫酸氫鈉修飾后測序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）檢測人黑素瘤細胞株A375、M14、SK-MEL-1、MV3和原代黑素細胞中IGFBP7基因啟動予區(qū)CpG島所有CpG位點的甲基化狀態(tài)，結果顯示，在IGFBP7表達陰性和陽性的細胞之間存在顯著的甲基化差異。
　　 35-aza-

4、dC對人黑素瘤A375、M14細胞IGFBP7的表達及生物學行為的影響
　　 應用去甲基化藥物5-aza-dC處理陰性表達IGFBP7的A375和M14細胞，藥物處理后，2株細胞IGFBP7mRNA和蛋白均恢復表達，且BSP檢測證實了該基因啟動子區(qū)發(fā)生了去甲基化改變，驗證了IGFBP7在這2株細胞中的表達恢復是該基因去甲基化的直接作用，表明啟動子區(qū)CpG島DNA異常甲基化是黑素瘤細胞IGFBP7表達改變的直接調控機制。
　

5、　 經(jīng)MTT實驗、流式細胞術、TUNEL法和transwell小室侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn)，5-aza-dC在體外抑制A375和M14細胞增殖，促進凋亡，并導致細胞周期出現(xiàn)G1期阻滯，抑制細胞侵襲。結合藥物處理后IGFBP7的表達變化，推測IGFBP7表達的恢復，很可能參與了5-aza-dC處理所引起的黑素瘤細胞上述生物學行為的改變。
　　 以上研究結果說明，IGFBP7基因啟動子區(qū)CpG島DNA異常甲基化是黑素瘤細胞中IGFBP7表