TFPI-2基因啟動子區(qū)異常甲基化與胰腺癌關(guān)系的研究.pdf

1、胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一,盡管最近的病理診斷、分子生物治療上有所發(fā)展,但總的階段生存率仍只有4％。盡管在一級預(yù)防、手術(shù)治療,放、化療聯(lián)合治療上做出了巨大努力,這些病人長時間的生存率未能得到本質(zhì)上的提高。和其他惡性腫瘤一樣,胰腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及到環(huán)境和遺傳等因素。在遺傳因素中,胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程與癌基因和抑癌基因密切相關(guān),癌基因和抑癌基因功能的改變在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。抑癌基因在控制細(xì)胞生長,增殖及分化過程中起著十分重

2、要的抑制作用,能潛在抑制腫瘤生長。如果抑癌基因的功能失活或出現(xiàn)基因缺失、突變等異常,就可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。抑癌基因失活的原因可有基因缺失、點突變、低表達和高甲基化等。其中抑癌基因的甲基化改變而導(dǎo)致該基因失活機制的研究逐漸受到重視。
　　人TFPI-2最早是由Jandial和Horne發(fā)現(xiàn)于胎盤而命名為胎盤蛋白-5。后人對 TFPI-2基因的研究逐步深入,發(fā)現(xiàn)其不但具有廣泛的抑制蛋白酶的作用,還具有抑制腫瘤發(fā)

3、生發(fā)展的作用。在已有的研究中,TFPI-2基因被認(rèn)為在肝癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、纖維肉瘤等多種惡性腫瘤中具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用,TFPI-2基因的缺失往往促進了腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。在另一方面,一些研究顯示,在腫瘤組織中TFPI-2基因缺失的原因可能與TFPI-2基因啟動子區(qū)高甲基化有關(guān)。據(jù)此,本研究以手術(shù)切除的胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織、胰腺癌Panc-1細(xì)胞株作為實驗對象,應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng),逆轉(zhuǎn)錄-

4、多聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),Western-blot和甲基化特異性PCR(MSP)等方法,研究胰腺癌及正常組織中TFPI-2基因甲基化狀態(tài)、胰腺癌Panc-1細(xì)胞在去甲基化藥物5-Aza-dC處理前后TFPI-2基因的mRNA及蛋白表達的變化。該實驗可見,TFPI-2基因表達的缺失與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的緊密相關(guān)性。進一步研究了TFPI-2基因表達的改變及其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的改變,以及TFPI-2基因甲基化狀態(tài)改變前后表達情況改變的機制

5、,為胰腺癌患者早期特異性診斷和預(yù)后判斷及去甲基化藥物干預(yù)治療提供客觀的觀察指標(biāo),并為開展胰腺癌的基因和分子治療提供實驗依據(jù)。本文從以下幾部分進行論述:
　　第一部分 胰腺癌組織與正常組織中TFPI-2基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究
　　目的:檢測胰腺癌組織TFPI-2(組織因子途徑抑制物-2)基因 CpG島甲基化的狀態(tài),并分析甲基化改變與胰腺癌的關(guān)系。
　　方法:應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)檢測45例胰腺癌組織

6、、相應(yīng)癌旁組織、8例正常胰腺組織中TFPI-2基因的甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:胰腺癌組織中TFPI-2基因的甲基化陽性率為71.1%(32/45),明顯高于癌旁組織的31.1%(14/45)(P<0.01)。8例正常胰腺組織中均未發(fā)生甲基化。TFPI-2基因甲基化陽性率還與胰腺癌的臨床分期、組織分化程度、腫瘤直徑具有相關(guān)性(P<0.05)。
　　結(jié)論:TFPI-2基因在胰腺癌組織中出現(xiàn)異常甲基化,可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切

7、。
　　第二部分 去甲基化藥物5-Aza-dC處理前后胰腺癌Panc-1細(xì)胞TFPI-2基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及表達的研究
　　目的:探討甲基化酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷對胰腺癌細(xì)胞系Panc-1中抑癌基因組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)甲基化水平及基因表達的影響。
　　方法:用不同濃度5-Aza-dC處理胰腺癌細(xì)胞系Panc-1。用甲基化特異性PCR(MS-PCR),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)及蛋白印

8、跡實驗(Western blot)檢測藥物處理前后Panc-1細(xì)胞TFPI-2基因的甲基化狀態(tài),mRNA及蛋白表達的改變。
　　結(jié)果:MSP檢測Panc-1細(xì)胞TFPI-2基因藥物作用后異常甲基化得到逆轉(zhuǎn),RT-PCR檢測到不同濃度5-Aza-dC處理后TFPI-2基因mRNA重新表達,相對表達量分別為0.211±0.087,0.327±0.068,0.609±0.017,Western Blot檢測TFPI-2基因蛋白重新表達,