葉酸缺乏介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)異常與散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤。從全球范圍來看，在西方發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，特別是北美、澳大利亞以及西歐的一些國家，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于發(fā)展中國家和經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)；大量調(diào)查研究顯示，相對于年齡、性別等因素來說，環(huán)境因素是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率升高的罪魁禍?zhǔn)?，其中影響最大的是飲食結(jié)構(gòu)的改變。隨著以高熱量、高脂肪、低纖維食物攝入量著稱的西方式飲食在人們飲食結(jié)構(gòu)比例中的增加，人們罹患結(jié)直腸癌的幾率也大大提高。近年來，表觀遺傳修飾

2、研究上取得的巨大進(jìn)展有助于人們?nèi)ジ玫睦斫膺@些生態(tài)學(xué)研究的結(jié)果。表觀遺傳修飾對于細(xì)胞正常的發(fā)育、分化是必不可少的，但是在病理狀態(tài)下，表觀遺傳修飾常常發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致疾病(包括腫瘤)的發(fā)生。目前研究最清楚、也是最重要的表觀遺傳修飾形式就是DNA甲基化，與遺傳學(xué)的改變不同，DNA甲基化的改變是可逆的，這使相關(guān)疾病的治愈成為可能。飲食，尤其是飲食中對于核酸、DNA合成必需的營養(yǎng)成分，是環(huán)境因素中影響DNA甲基化最主要的因素，這些營養(yǎng)成分主要

3、包括氨基酸、鋅、葉酸以及維生素等。
　　 作為最重要的一種營養(yǎng)成分，葉酸是B族維生素中的一員，同時也是綠葉蔬菜、豆類和柑橘中的天然成分。大量的隨訪研究證實(shí)，葉酸的攝入量與罹患結(jié)直腸癌的危險性之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。因?yàn)樵谝惶紗挝坏拇x中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，所以葉酸對于DNA合成和甲基化修飾都是至關(guān)重要的。近年來，關(guān)于葉酸缺乏導(dǎo)致結(jié)直腸細(xì)胞基因組DNA甲基化水平異常的研究報道屢見不鮮，但是不同研究的結(jié)果存在著巨大的矛盾；目前結(jié)直腸細(xì)胞基因組

4、DNA的整體甲基化水平以及與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的甲基化位點(diǎn)仍然有待于進(jìn)一步的篩查。曾有研究人員提出，對結(jié)直腸粘膜上皮細(xì)胞中的某些甲基化位點(diǎn)進(jìn)行檢測能夠?qū)Y(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供巨大的幫助，但是這一點(diǎn)仍然沒有得到基礎(chǔ)和臨床研究數(shù)據(jù)的支持。
　　 本研究將通過甲基化芯片對葉酸缺乏導(dǎo)致人正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞(NCM460)的DNA甲基化狀態(tài)變化情況進(jìn)行篩查，并對相關(guān)位點(diǎn)與散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行深入探討。借助于N

5、imbleGen公司的甲基化芯片(Methylated DNAImmunoprecipitation chip assay)，我們對不同葉酸濃度下培養(yǎng)的NCM460細(xì)胞中基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，并通過結(jié)合重亞硫酸鹽的測序方法在細(xì)胞和結(jié)直腸癌患者的組織樣本中對芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。我們發(fā)現(xiàn)在21號染色體上，17個基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生了超甲基化或去甲基化的改變，其中8個基因甲基化狀態(tài)的改變可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)。在此基

6、礎(chǔ)上，通過實(shí)時定量PCR和免疫組織化學(xué)，我們探討了甲基代謝中的重要基因——胱硫醚-β-合酶啟動子區(qū)的超甲基化與基因表達(dá)之間的相關(guān)性；與此同時，通過檢測胱硫醚-β-合酶的直接底物——同型半胱氨酸，我們探討了啟動子超甲基化與基因功能之間的相關(guān)性；此外，我們還對患者腫瘤組織中胱硫醚-β-合酶啟動子區(qū)甲基化水平與結(jié)直腸癌臨床特征之間的相關(guān)性進(jìn)行了統(tǒng)計分析；其中，單因素分析顯示胱硫醚-β-合酶啟動子的甲基化水平與腫瘤分期、復(fù)發(fā)、腫瘤相關(guān)的死亡、免

7、于復(fù)發(fā)的可能性、總體生存率等臨床特征密切相關(guān)，多因素分析顯示，不依賴于腫瘤分期等其他臨床特征，胱硫醚-β-合酶啟動子的甲基化水平能夠獨(dú)立指示結(jié)直腸癌患者的復(fù)發(fā)率和總體生存率。我們的研究證明，葉酸缺乏能夠介導(dǎo)腫瘤相關(guān)基因發(fā)生甲基化狀態(tài)異常依賴性的表達(dá)變化，其中胱硫醚-β-合酶啟動子的甲基化狀態(tài)異?？赡芡ㄟ^影響細(xì)胞的甲基代謝進(jìn)而參與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的一系列生理過程，胱硫醚-β-合酶啟動子甲基化水平能夠作為一個有效的標(biāo)志物應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早