BRCA1啟動子甲基化與散發(fā)性乳腺癌的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：乳腺癌(Breast cancer, BC)這一惡性腫瘤，嚴(yán)重地影響著女性的生命健康。乳腺癌可以分為兩種類型，家族性和散發(fā)性，其中大部分(約為95％)是散發(fā)性乳腺癌，家族性約占5%。乳腺癌易感基因1（Breast cancer susceptibility gene1，BRCA1）的突變對家族性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有著非常重要意義。但是，研究發(fā)現(xiàn)在散發(fā)性乳腺癌中，BRCA1基因的序列是完整的，卻存在著其轉(zhuǎn)錄的 mRNA明顯減少這一現(xiàn)象

2、，說明BRCA1基因依靠其他的機制參與了散發(fā)型乳腺癌的發(fā)生。目前的研究認(rèn)為抑癌基因 DNA異常甲基化在正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變以及在惡性腫瘤的侵襲性逐漸增強的過程中占有重要的作用。有研究表明，BRCA1基因啟動子異常甲基化與BRCA1基因表達(dá)的缺失及散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并且散發(fā)性三陰性乳腺癌這一基因啟動子甲基化的概率高于其他類型。本實驗擬在散發(fā)性乳腺癌的癌組織中，檢測BRCA1啟動子中CpG島的甲基化頻率，比較在不同類型的乳腺

3、癌中甲基化率的差異，探討乳腺癌易感基因 BRCA1啟動子甲基化和散發(fā)性乳腺癌的臨床特點之間的關(guān)系，并為其預(yù)后提供指導(dǎo)作用。
　　方法：
　　1、實驗對象
　　隨機選擇河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心2014年4月-2015年3月乳腺癌患者79例，均為女性，年齡處于27~81歲，中位年齡為53歲。患者術(shù)前均經(jīng)空心針穿刺病理證實為乳腺癌，且未行放療、化療及內(nèi)分泌治療。無乳腺癌家族史，無既往其他惡性腫瘤病史。
　　根據(jù)20

4、13年6月美國臨床腫瘤協(xié)會(American Society of Clinical Oncology，ASCO)、美國病理醫(yī)師學(xué)院(College of American Pathologists， CAP)頒布的乳腺癌雌激素受體(Estrogen receptor, ER)、孕激素受體(Progesterone receptor, PR)及Her2蛋白免疫組織化學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)，按照St. Gallen2013年專家共識及免疫組化結(jié)果，將

5、79例患者分為四個亞型：(1)Luminal A型乳腺癌22例，指ER/PR陽性且PR高表達(dá)（≥20%）、Her2陰性、Ki-67低表達(dá)（＜14%）的乳腺癌；(2) Luminal B型乳腺癌19例，指ER/PR陽性，若Her2陰性時Ki-67高表達(dá)或PR低表達(dá)，若Her2陽性時Ki-67可任何狀態(tài)的乳腺癌；(3)Her2陽性型乳腺癌18例，指Her2陽性，ER、PR皆為陰性的乳腺癌；(4)三陰性乳腺癌20例，指ER、PR均為陰性，無

6、Her2蛋白過表達(dá)或基因擴增的乳腺癌。并且詳細(xì)記錄臨床病理資料。
　　2、實驗過程
　　采用組織DNA提取試劑盒提取DNA，并行亞硫酸氫鹽處理DNA，則未甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，隨后以5'-TATTTTTGTGGGGTGAATTTAATATG-3'為上游引物,5'-CCCTCAACC CCAATATTTATTATTT-3'為下游引物，進(jìn)行PCR擴增BRCA1啟動子CpG島的目的序列，長為195bp

7、，在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，將PCR產(chǎn)物克隆至T載體后提取質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，即亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP)。同時在病理科用該79名患者的乳腺癌組織石蠟標(biāo)本，行免疫組織化學(xué)染色檢測。
　　3、統(tǒng)計分析
　　采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，檢驗水準(zhǔn)為0.05。對計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s）表示，對計數(shù)資料采用n（%）表示。計數(shù)資料統(tǒng)

8、計采用卡方檢驗（χ2）。因為各組的甲基化率不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）描述，兩組間的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，多組間的比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。
　　結(jié)果：
　　1、乳腺癌各分子亞型臨床生物學(xué)特性的比較
　　實驗中各亞型患者的年齡、T分期（腫瘤大?。?、N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)）、TNM分期、病理類型及組織學(xué)分級經(jīng)統(tǒng)計學(xué)（卡方檢驗）分析：
　　在病理類型方面，三陰

9、型和其他分子亞型（Luminal A型，Luminal B型，Her2陽性型）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（分別為χ2=10.462，P=0.015<0.05;χ2=10.181，P=0.017<0.05;χ2=7.110，P=0.029<0.05），三陰型主要以乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和髓樣癌為主，其他分子亞型主要為浸潤性導(dǎo)管癌。
　　在組織學(xué)分級方面，（1）Luminal A型和其他分子亞型（Luminal B型， Her2陽性型，三陰型）比較有

10、統(tǒng)計學(xué)差異（分別為χ2=7.819， P=0.020<0.05；χ2=24.130，P=0.000<0.05；χ2=15.724，P=0.000<0.05）， Luminal A型主要為II級，其他分子亞型主要為III級；（2）Luminal B型和Her2陽性型比較有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=7.441，P=0.006<0.05），Luminal B型主要為II級和III級，Her2陽性型主要為III級。
　　其他分組的指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差

11、異（P均>0.05）。
　　2、整體12個位點的甲基化情況的描述
　　經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，12個位點的甲基化頻率最高的為位點-842和位點-782，都為65.8%，說明這兩個位點甲基化狀態(tài)較常見，最低的為位點-742，為10.1%，說明該位點甲基化狀態(tài)較少見。
　　3、乳腺癌各分子亞型的12個位點的甲基化概率的差異性比較
　　經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，（1）對于CpG位點-881的甲基化率，Luminal B型分別高于三陰型和 H

12、er2陽性型（χ2=8.046，P=0.005<0.05;χ2=4.937， P=0.026<0.05）；（2）對于CpG位點-764的甲基化率，三陰型高于Luminal A型（χ2=8.066，P=0.005<0.05）；（3）對于CpG位點-742的甲基化率，三陰型分別高于Luminal A型和Luminal B型（χ2=7.700，P=0.006<0.05;χ2=6.736，P=0.009<0.05）；（4）其他位點在各分子分型中

13、的甲基化率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）。
　　4、不同分子亞型總體甲基化率的差異性比較
　　經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，四個亞型的總體甲基化率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.954＞0.05）。
　　5、三陰型和其他分子亞型（Luminal A型+Luminal B型+Her2陽性型）的總體甲基化率的差異性比較經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，三陰型和其他分子亞型的總體甲基化率無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.642＞0.05）。
　　6、各組或各樣本甲基化率與

14、臨床生物學(xué)特性之間的關(guān)系或趨勢
　　經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，不同臨床資料分組的患者的總體甲基化率無統(tǒng)計學(xué)差異（P均>0.05）,說明甲基化情況與上述臨床資料無關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論：
　　1、BRCA1啟動子CpG位點-842和位點-782的甲基化可能與散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。三陰性乳腺癌中CpG位點-764和位點-742的甲基化率均高于Luminal A型乳腺癌，三陰性乳腺癌中CpG位點-742的甲基化率高于Luminal B型乳腺

15、癌。CpG位點-764和位點-742可能與散發(fā)性三陰性乳腺癌的發(fā)生相關(guān)，需進(jìn)一步研究。
　　2、散發(fā)性三陰性乳腺癌患者中 BRCA1基因啟動子（距轉(zhuǎn)錄起始點-908~-714的基因序列）的甲基化率與其他分型的散發(fā)性乳腺癌（Luminal A型、Luminal B型、Her2陽性型）甲基化率無明顯差別。
　　3、散發(fā)性乳腺癌BRCA1啟動子的甲基化率與患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理類型及組織學(xué)分級無明顯關(guān)聯(lián)