Rassf10基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在結(jié)直腸癌中的研究.pdf

1、背景結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)位于癌癥相關(guān)死亡原因第三位。全球每年大約有123萬例CRC患者被確診，嚴(yán)重威脅著人類的健康。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，研究表明其發(fā)生發(fā)展不僅涉及多基因的改變，而且還與表觀遺傳學(xué)的改變密切相關(guān)。多腫瘤抑制基因的表觀遺傳學(xué)失活，尤其是DNA甲基化，越來越受到人們的重視。近來研究發(fā)現(xiàn)Rassf基因家族表觀遺傳學(xué)失活在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起重要作用。Rass

2、f(Ras association domain family)是Ras信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)基因家族，具有抑制腫瘤發(fā)生的作用，包括Rassf1-10十個(gè)成員，其大多數(shù)成員都因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生表達(dá)缺失而在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)Rassf10基因在胃癌、甲狀腺癌、惡性黑色素瘤、兒童急性淋巴細(xì)胞白血病及前列腺癌中存在頻繁甲基化，是潛在的候選抑癌基因。但在結(jié)直腸癌中未見類似報(bào)道，Rassf10在結(jié)直腸癌中的甲基化狀態(tài)尚不清

3、楚。
　　目的：本研究旨在檢測(cè)Rassf10在結(jié)直腸癌及結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)及甲基化情況，在轉(zhuǎn)錄水平研究其mRNA表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)甲基化的關(guān)系，并應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析Rassf10甲基化和結(jié)直腸癌臨床指征的關(guān)系，探討Rassf10在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　方法：本課題選用了7株結(jié)直腸癌細(xì)胞系，分別是:LOVO、RKO、DLD1、HCT116、HT29、SW620和

4、SW480。應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中Rassf10基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2-deoxycytidine(5-aza-dc)處理前后Rassf10在mRNA水平的表達(dá)變化，探討其表達(dá)是否受啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和MSP等方法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中Rassf10的表達(dá)及甲基化情況，結(jié)合臨床資料，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)分析，探討Rassf10在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測(cè)7株細(xì)胞系LOVO、RKO、DLD1、HCT116、HT29、SW620和SW480的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)LOVO、RKO和HCT116中Rassf10存在完全甲基化改變，余呈部分甲基化改變。
　　2.半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)以上7株結(jié)直腸癌細(xì)胞去甲基化藥物5-aza-dc處理前后Rassf10mRNA水平變化，發(fā)現(xiàn)

6、在LOVO、RKO和HCT116中Rassf10mRNA不表達(dá)，經(jīng)5-aza-dc處理后恢復(fù)表達(dá)，HT29、SW480和SW620處理后Rassf10mRNA表達(dá)水平增加。結(jié)合MSP結(jié)果提示Rassf10在結(jié)直腸癌中因啟動(dòng)子區(qū)甲基化表達(dá)下調(diào)。
　　3.20例配對(duì)結(jié)直腸癌與癌旁組織免疫組化結(jié)果顯示Rassf10在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，統(tǒng)計(jì)分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.在90例人結(jié)直腸癌組織中，Rassf1

7、0甲基化率為60％（54/90例），而在正常結(jié)直腸組織中均未見甲基化改變（0/10例）。Rassf10啟動(dòng)子區(qū)甲基化與患者的性別、年齡及腫瘤組織分化程度無明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性(P＜0.05)，腫瘤分級(jí)Ⅲ-Ⅳ期較Ⅰ-Ⅱ期的患者甲基化率明顯高，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Rassf10甲基化率明顯高。
　　結(jié)論：
　　1.Rassf10啟動(dòng)子區(qū)在結(jié)直腸癌中存在異常高甲基化