結直腸癌p16基因甲基化及基因表達的探討.pdf

1、[目的]
　　 分析結直腸癌組織和癌旁組織p16基因外顯子1、2的甲基化水平，檢測P16蛋白在結直腸癌及相應癌旁組織中的表達，探討p16基因甲基化、P16蛋白表達與結直腸癌之間的相關性，以及p16基因甲基化與P16蛋白表達的關系，為進一步探討結直腸癌發(fā)生發(fā)展的機理提供新的思路。
　　 [方法]
　　 1.收集30例手術切除且病理確診結直腸癌在術中留取的癌組織及癌旁組織標本，冷凍保存。采用酚仿法提取DNA，用紫外分

2、光光度計進行DNA濃度以及純度的檢測。
　　 2.在NCBI網(wǎng)站上找到p16基因序列，利用MethPrimer軟件對p16基因進行CpG島分析，根據(jù)分析結果用Primer5.0軟件對p16基因外顯子1、2的CpG島分別設計引物。
　　 3.提取DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，對p16基因不同片段分別進行PCR擴增，所得擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化、甲酸裂解后，用LC-MS/MS進行分析。
　　 4.組織經(jīng)固定、包埋及切

3、片，應用免疫組織化學S-P染色法檢測P16蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況。對實驗結果進行統(tǒng)計學分析。
　　 [結果]
　　 1.對p16基因進行CpG島分析，發(fā)現(xiàn)基因exon1和exon2均含有密度較高的CpG島，分別對各區(qū)域進行引物設計及PCR，成功擴增出p16 exon1(392bp)和exon2(333bp)。
　　 2.30例結直腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織p16 exon1的平均甲基化水平分別為

4、3.58％和3.28％，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而exon2在腫瘤組織和癌旁組織中的平均甲基化水平分別為29.80％和3.47％，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。不同的Dukes'分期、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移程度間p16 exon1和exon2的甲基化水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3.30例結直腸癌患者腫瘤組織中7例有P16蛋白表達，陽性表達率為23％(7/30);相對應的癌旁正常組織中2

5、2例有P16蛋白表達，陽性表達率為73％(22/30)。兩者比較差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P＜0.01）。而且P16蛋白表達在不同Dukes'分期、淋巴結轉(zhuǎn)移程度和分化程度間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 [結論]
　　 結直腸癌中p16基因外顯子1的甲基化水平無明顯改變，而外顯子2存在明顯的高甲基化。與癌旁正常組織相比，P16蛋白在結直腸癌中呈低表達。這些結果表明，p16基因外顯子2的甲基化可能抑制基因表達，